摘要 目前，小立碗藓已经成为一种重要的功能基因组学研究的模式植物。将小立碗藓接种于舍不同浓度潮霉素的BCDATG培养基上，观察小立碗藓对不同浓度潮霉素的敏感程度。结果表明：随着潮霉素浓度的增加，小立碗薛的生长受到不同程度地抑制。因此，潮霉素可以作为一种筛选标记对转基因小立碗藓进行筛选。
关键词 潮霉素；小立碗藓；浓度；敏感性
中图分类号 Q949.352 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)02-0036-01
苔藓植物中的小立碗藓[Physcomit rellapatens(Hedw.B.S.G.)]隶属于葫芦藓目(Funariales)葫芦藓科(Funariaceae)小立碗藓属(Physcomitrella)。在植物界，苔藓植物小立碗藓是唯一一种能够通过高效率同源重组的方式整合外源DNA的物种。并且能够进行高效、精确的基因打靶，从而成为研究植物功能基因组学的模式生物。
目前，对于小立碗藓的培养转化体系已经比较完善。在正常条件下，小立碗藓大概8周可以完成一个生殖周期，可大大缩短试验周期，同时由于其个体小，有利于规模化培养和突变体筛选。其次，小立碗藓单倍体的配子体占据主要世代，有利于突变的产生和遗传性状的直接分析。研究过程中最常用的方法是利用基因敲除获得突变植株，用于基因结构与功能、表达与调控、细胞生活周期调控机制等方面的研究。而用目的基因携带的选择标记基因来筛选、鉴定外源目的基因，能高效、准确地鉴定出突变体。
潮霉素是植物基因工程研究中使用较为广泛的转化体筛选抗生素，它是一种很强的细胞生长抑制剂，通过与70s和80s核糖体的结合。对许多原核生物与真核生物的生长起抑制作用。HPT酶能催化ATP上γ―磷酸基团转移至潮霉素分子上而使之失活。因此，使用hpt基因作为转化供体可赋予转化植物细胞抗潮霉素的能力。由于不确定小立碗藓对潮霉素的敏感程度，因而在小立碗藓中没有广泛的应用。该试验通过对小立碗藓在含不同浓度潮霉素培养基上的生长情况进行观察和分析，以为潮霉素作为一种筛选标记来筛选转基因小立碗藓提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
小立碗藓由中科院遗传所提供。采用的小立碗藓培养基为BCDATG固体培养基。选取在BCDATG固体培养基上生长3周的小立碗藓茎叶体作为试验材料。
1.2 试验方法
用镊子取小立碗藓茎叶体植株的茎尖部分，分别转至含0、10、20、30、40、50、60、70mg/L潮霉素的BCDATG固体培养基上。培养方法参照Ashton的方法。培养条件：(25±1)℃，16h光照，8h黑暗，光密度55μmol/(m2・s)。培养14d后观察敏感性表型，并分别称量10棵植株的重量，每个浓度重复3次，求平均值。
2 结果与分析
从图1可以看出，14d后，不含潮霉素的BCDATG培养基上的小立碗藓生长状况正常，植株健壮，没有黄化(图1a)；而在含有潮霉素的培养基中，茎叶体生长缓慢，植株出现不同程度的黄化，潮霉素浓度越高，抑制越强烈(图1b-h)。在转至含有潮霉素的培养基上14d后，生长在10、20、30mg/L潮霉素的BCDATG培养基上的植株(图1b-d)所受到的抑制不是很强，植株虽然生长缓慢，但有分生芽出现，且没有出现黄化。生长在40mg/L潮霉素的BCDATG培养基上的植株(图1e)及该浓度以上培养基上的植株(图1f-h)开始明显出现黄化，并停止生长，最终所有生长在含潮霉素培养基上的幼苗都会死亡。
从图2可以看出，随着潮霉素浓度的增加，植株的鲜重显著降低，在50mg/L潮霉素的BCDATG培养基上时，大部分植株已经死亡，鲜重不再降低。因此，估测潮霉素琼脂处理筛选转基因小立碗藓的最适浓度为60mg/L。
3 结论与讨论在植物基因工程研究中，高效、准确地从大量转化群体中筛选出含有外源目的基因的转化体是成功获得转基因植株的关键。对不同浓度潮霉素的筛选效果进行研究，是潮霉素在小立碗藓遗传转化中应用的基础。试验结果表明，在含潮霉素的培养基上，小立碗藓植株在转接14d后生长均受到不同程度地抑制。在所测浓度梯度中，14d后，均出现植株黄化及抑制生长的表型，最终死亡。但是仅凭此现象还不足以完全确定是否为转基因株系，在实际操作中还应结合PCR检测、Southem杂交等方法来进行筛选。