摘要：从３龄思茅松毛虫（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ）幼虫肠道样品中分离得到１１株好氧细菌。以细菌基因组ＤＮＡ为模板，扩增１６ Ｓ ｒＤＮＡ，并用４种限制性内切酶Ｈａｅ Ⅲ和Ｈｉｎｄ Ⅲ、Ｈｉｎｆ Ⅰ和Ｔａｑ Ⅰ对ＰＣＲ扩增产物进行ＡＲＤＲＡ多态性分析。对聚类图谱的分析结果发现１１株好氧细菌在７０％的遗传相似度水平上聚成４个不同分类操作单元（ＯＴＵ），表明３龄松毛虫中肠道内好氧细菌的遗传多样性水平偏低。
关键词：肠道细菌；多样性；ＡＲＤＲＡ；思茅松毛虫（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ）
中图分类号：Ｑ９３９．１２１；Ｑ９６８．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）07－1481-03
Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Inｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｅｒｏｂｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ３ｔｈ Ｉｎｓｔａｒ
Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ Ｌａｒｖａｅ ｂｙ ＡＲＤＲＡ
ＫＡＮＧ Ｌｉｕ，ＷＡＮＧ Ｊｉｎ－ｈｕａ，ＳＵＮ Ｙｏｕ－ｈｅ，ＧＡＯ Ｙａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｋａｉ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ／ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： １１ ａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｏｆ ３ｔｈ instar Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕ ｋｉｋｕｃｈｉｉ ｌａｒｖａｅ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ， １６ Ｓ ｒＤＮＡ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ． ４ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｈａｅ Ⅲ ａｎｄ Ｈｉｎｄ Ⅲ， Ｈｉｎｆ Ⅰａｎｄ Ｔａｑ Ⅰ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ＡＲDＲＡ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ １１ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ４ ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔs（ＯＴＵs） ｏｎ ７０％ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｌｅｖｅｌ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ’s ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ３ｔｈ instar Ｄ． ｋｉｋｕｃｈｉｉ ｌａｒｖａｅ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｌｏｗ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ； ＡＲＤＲＡ； Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕ ｋｉｋｕｃｈｉｉ
思茅松毛虫（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）隶属鳞翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）枯叶蛾科（Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）松毛虫属（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ），在我国云南地区分布广泛［１］，为害马尾松、思茅松、云南松等，其体型大，幼虫龄期长，取食量大，是我国南方松树的重要害虫之一。目前松毛虫防治主要采用天敌、化学农药和绿僵菌等措施，环境污染严重，效果受天气影响较大，因此大力开发稳定性较好的生物农药非常必要。
昆虫肠道中存在的微生物菌群与昆虫的营养、免疫等生理活动密切相关。肠道微生物的改变直接影响昆虫的进食、生长发育，近年来已成为研究的热点。国内对昆虫肠道微生物的研究主要集中在家蚕、桑粒肩天牛、中华真地鳖、东亚飞蝗和黑粉虫等［２－９］，而松毛虫肠道微生物的研究报道较少。
原核生物１６ Ｓ ｒＤＮＡ区段保守性高、携带的信息量大，用ＡＲＤＲＡ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒＤＮＡ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）多态性分析的方法可以十分方便地对分离的菌株进行类群划分，简化传统分类鉴定方法的繁琐过程［１０］。因此，实验菌株１６ Ｓ ｒＤＮＡ的扩增及酶切图谱可以有效地反映细菌的多样性。本实验通过研究松毛虫肠道内好氧细菌的多样性，为研究松毛虫与肠道微生物的关系提供科学依据；为后期利用肠道弱势菌群饲喂松毛虫，改变其肠菌多样性，影响其生长发育、杀虫等提供种质资源，以期开发出新的杀虫效力稳定的生物杀虫剂。
１ 材料与方法
１．１ 样品的采集
于２０１１年３～５月采集西南林业大学后山的健康思茅松毛虫。将采集的思茅松毛虫养殖在适度条件下的网状养殖箱内，每天更换新鲜的松树枝。用游标卡尺测量思茅松毛虫的大小，３龄思茅松毛虫体长为９．０～１１．０ ｍｍ、头宽１．５～２．５ ｍｍ，选取健康的３ 龄思茅松毛虫为本实验的样品。
１．２ 培养基与试剂
平板分离培养基采用营养肉汤培养基，纯化培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基；细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒、ＰＣＲ试剂、限制性内切酶等购自天根生化科技（北京）有限公司。
１．３ 细菌的分离和纯化
将３龄松毛虫用无菌水饲养３ ｄ，排尽其肠道食物。将虫体于升汞溶液中浸泡１０ ｓ，期间用镊子翻动虫体，使消毒彻底。再用无菌水冲洗虫体５ ｍｉｎ，重复３次。在无菌条件下解剖松毛虫取中肠，研磨捣碎后加１ ｍＬ无菌水制成肠道匀浆悬液，备用。
将肠道匀浆悬液按１×（１０－１～１０－８）用无菌水倍比稀释，各取１ ｍＬ涂布于营养肉汤培养基上，置于２８ ℃培养箱中暗培养７ ｄ。挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线纯化。纯菌株于４ ℃斜面保藏。每处理重复３次。
１．４ 菌体基因组ＤＮＡ的提取
用细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取好氧细菌单菌落的基因组ＤＮＡ。
１．５ １６ Ｓ ｒＤＮＡ的扩增
以１６ Ｓ ｒDＮＡ的通用引物进行ＰＣＲ扩增，引物序列为：正向引物２７ｆ（５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′）和反向引物１４９２ｒ（５′－ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３′）。反应体系为：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ＭｇＣｌ２ ３ μＬ，ｄＮＴＰs １ μＬ，引物各１ μＬ，ＤＮＡ模板１ μＬ，Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ）０．５ μＬ，无菌水补足５０ μＬ。反应程序：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变化１ ｍｉｎ，５６ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸３ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ。０．８％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物。
１．６ ＡＲＤＲＡ分析
１．６．１ 酶切 用两组４种限制性内切酶对１６ Ｓ ｒDＮＡ基因扩增产物进行酶切。①ＨａｅⅢ 和 ＨｉｎｄⅢ的酶切。反应体系：ＨａｅⅢ １ μＬ，Ｈｉｎｄ Ⅲ １ μＬ，１０×Ｍ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，ＤＮＡ １０ μＬ，灭菌水补足２０ μＬ。反应条件：３７ ℃过夜，０．８％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。②ＨｉｎｆⅠ和ＴａｑⅠ的酶切。反应体系：ＨｉｎｆⅠ１ μＬ，ＴａｑⅠ１ μＬ，１０×ＴａｑⅠＢａｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，０．１％ＢＳＡ ２ μＬ，ＤＮＡ １０ μＬ，灭菌水补足２０ μＬ。反应条件：３７ ℃ ２～３ ｈ，６５ ℃ ２ ｈ，０．８％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
１．６．２ 多态性分析 用软件Ｌａｂｉｍａｇｅ ２．０将琼脂糖凝胶上出现的ＤＮＡ带谱转化为分子量信息，按“出现”记为１，“不出现”记为０，进行统计。模糊条带及分子量小于８０ ｂｐ的条带忽略不计。根据条带数目及分子量大小进行分析，用ＭＶＳＰ软件将０，１数据处理为０，１矩阵；进行ＵＰＧＭＡ分析，构建聚类树。
２ 结果与分析
２．１ ３龄松毛虫肠道好氧细菌的分离
３龄松毛虫中肠道匀浆悬液经倍比稀释涂布培养后，共分离得到１１株好氧细菌，编号为１～１１。
２．２ １６ Ｓ ｒＤＮＡ扩增结果
以提取的１１株分离菌株基因组ＤＮＡ为模板扩增１６ Ｓ ｒＤＮＡ，得到重复性好、稳定清晰的特异片段，见图１。电泳结果显示ＰＣＲ扩增出了长度约为１．５ ｋｂ的细菌１６ Ｓ ｒＤＮＡ近似全序列。
２．３ ３龄松毛虫肠道好氧细菌的ＡＲＤＲＡ分析
ＡＲＤＲＡ可在１６ Ｓ ｒDＮＡ基因序列上区分细菌种的差异；每１个１６ Ｓ ｒＤＮＡ限制片段长度多态性类型代表了一个操作分类单位（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔ， ＯＴＵ），用这种方法显示的ＯＴＵｓ多样性能用以估计分离物中存在的最低限度的细菌种的数目［１０］。用限制性内切酶Ｈａｅ Ⅲ和Ｈｉｎｄ Ⅲ对ＰＣＲ产物进行ＡＲＤＲＡ多态性分析，１１个菌株共显示了３种不同的ＡＲＤＡＲ谱带类型（图２Ａ），即得到了３个ＯＴＵｓ，表明至少存在３种不同的细菌。用ＨｉｎｆⅠ和ＴａｑⅠ对ＰＣＲ产物进行ＡＲＤＲＡ多态性分析，１１个菌株共显示了５种不同的ＡＲＤＡＲ谱带类型（图２ Ｂ），即得到了５个ＯＴＵｓ。电泳图谱表明，ＨｉｎｆⅠ和ＴａｑⅠ的酶切图谱多样性更丰富，较适用于昆虫肠道细菌的鉴定。根据Ｈｉｎｄ Ⅲ、Ｈａｅ Ⅲ、ＨｉｎｆⅠ及ＴａｑⅠ４种内切酶酶切结果，对１１株菌进行ＵＰＧＭＡ分析，得到聚类树（图３）。由图３可知，３龄松毛虫肠道的１１株好氧细菌在７０％的遗传相似度水平上聚成4个类群，第Ⅰ类群有５株，占４５．４５％，为３龄松毛虫肠道优势菌群；第Ⅱ类群与第Ⅳ类群各有１株，占９.09％，为３龄松毛虫肠道弱势菌群；第Ⅲ类群有４株，占３６．３６％。ＡＲＤＲＡ分型结果初步表明，３龄松毛虫肠道好氧细菌群落的相似度很大，遗传多样性水平偏低。
３ 讨论
动物肠道内的细菌密度是所有生态环境里最大的，但是类别却是最简单的［2］。本实验从３龄松毛虫肠道中共分离得到可培养的好氧细菌１１株，经ＡＲＤＲＡ聚类分析，在７０％的遗传相似度水平上归属４个类群，说明３龄松毛虫肠道内好氧细菌的多样性水平偏低，这可能是因为松毛虫的草食性生活习性建立了肠道特定的营养环境，肠道微生物也通过复杂的调控过程形成了具有一定稳定性的微生物群系。而这个微生物群系可能根据食物和进入的微生物的特点而发生变化。因此后期试验将利用松毛虫肠道弱势菌群培养物喷洒无菌草叶饲喂松毛虫，观察弱势菌群对松毛虫肠道微生物多样性的影响，分析肠道微生物多样性的变化对松毛虫个体生长发育及代谢的影响，以期找到松毛虫生物防治的新方法，达到预防和控制的目的。
本研究分离得到的各种好氧细菌菌株的系统发育关系，以及各自分类地位的鉴定等有待于后续研究。
参考文献：
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