再灌注治疗虽然是缺血性卒中的最佳治疗方法，但狭窄的治疗时间窗限制了其在临床上的应用1。亚低温（28～35℃）具有确切的的神经保护手段2。为此，观察了再灌注期内实施亚低温能否延长再灌注治疗时间窗并观察了Bcl-2、Bax、AQP4的表达，探讨了其可能的机理。
资料与方法
动物分组及主要试剂：将健康雄性Wistar大鼠72只随机分为假手术组6只；大脑中动脉闭塞（MCAO）24小时组6只；常温再灌注组：按再灌注时间点不同分为几个时相点：MCAO 2、3、4、5、6小时，每个时相点6只；亚低温再灌注组：时相点同常温组，每个时相点6只。动物均于再灌注24小时后处死，但MCAO 24小时组大脑中动脉闭塞24小时后直接处死。。用Koizumi改良线拴法制备大鼠大脑中动脉缺血/灌注模型。Bcl-2多克隆抗体（sc-492兔抗）及Bax单克隆抗体（sc-7480小鼠抗）均购自美国Santa Cruz。TUNEL试剂盒购自美国Roche。AQP4试剂盒购自武汉博士德公司。氯化三苯基四氮唑2，3，5Tripheny ltetrazoliumchloride（TTC染色剂）试剂购自Sigma。采用改良的Longa等法制备大鼠MCAO模型。
局部亚低温方法：应用贴敷式局部亚低温治疗仪。造模成功后，使顶部头皮与局部亚低温治疗仪的探头紧密接触，采用SL-4型温度传感器（武汉同济医科大学研制）于亚低温在10分钟内测大鼠鼻咽部温度和鼓膜温度33.6±0.5℃，表明脑温可降至33±0.5℃。亚低温治疗时间持续5小时，同时监测大鼠的直肠温度和呼吸。亚低温结束后将大鼠置于室温（25℃）下自然复温。
观察梗死体积：应用ImageJ 1.34图像分析软件，手工标出梗死灶边框，测出梗死面积及缺血侧半球面积，梗死体积（mm3）=梗死面积（mm2）×厚度（m）。校正梗死体积（mm3）=左半球体积（mm3）-（右半球体积（mm3）-直接测量出的梗死体积（mm3）。为了减少大鼠个体差异造成的影响，本研究采用梗死体积占半球体积百分值（V）表示，V=校正梗死体积/缺血半球体积×100%。
用干-湿质量法测定脑含水量：在规定的时间点将大鼠处死断头取脑，将大脑半球分开，分别测湿质量，置110℃电烤箱24小时，再迅速测干质量。脑含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。
观测指标及方法：亚低温组和常温组在规定的时间点取材，假手术组于术后24小时取材。用4%多聚甲醛经心脏灌注固定后取脑，置于4%多聚甲醛（含1/5000 DEPC）后固定2小时，酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。连续冠状切片，切片厚度7μm。分别进行Bcl-2、Bax、AQP4的免疫组化、TUNEL阳性细胞检测。检测程序均按相应试剂盒说明进行。凋亡细胞计数方法：选取脑额顶部皮层部位，200倍光镜下计数5个视野阳性细胞数目，求其平均值。对照组凋亡细胞主要见于梗死灶及周围的纹状体与额顶部皮层。Bcl-2、Bax、AQP4也主要分布于梗死灶周围的纹状体及额顶部皮层。
统计学处理：应用SPSS17.0软件进行统计处理。所有数据均用（X±S）表示。采用t检验。P0.05）；亚低温组MCAO 2～4小时再灌注24小时差异有显著性（P0.05）。亚低温再灌注组各时相点的梗死体积、Longa评分、脑含水量、TUNEL阳性细胞数、Bax、AQP4的表达均显著低于相应常温组，Bcl-2的表达显著高于常温组（P3，这极大的限制了再灌注治疗的应用。如何扩展血管再通治疗时间窗，已成为神经病学急需解决的热点问题。现有研究表明延长再灌注治疗时间窗的方法有数种，但都有一定的局限性4～7；现有研究亚低温具有确切的脑保护作用，而且临床应用比较成熟，但缺乏其对脑缺血再灌注治疗时间窗的研究。结合临床实际即患者只可能在入院后予以大脑局部亚低温干预，故本研究在亚低温开始的时间点上选择了在血管再通期（再灌注期）作为观察点，这样更贴近临床实际。首先通过再灌注时间点不同的常温组与脑梗死近期（24小时）结局即MCAO 24小时组的梗死体积及TUNEL阳性细胞数的比较，得出本组试验常温下的有效再灌注治疗时间窗；然后通过比较血管再通时间点不同的亚低温组与MCAO 24小时组的上述指标，得出本组试验在亚低温条件下的有效再灌注治疗时间窗。本研究提示，本组大鼠常温下大脑中动脉的再灌注治疗的有效时间窗为血管闭塞后3小时。但在亚低温干预下再灌注治疗的有效时间窗为血管闭塞后4小时。结果提示再灌注期局部亚低温能够延长再灌注治疗时间窗。
本研究结果显示，亚低温再灌注组各时相点的梗死体积、脑含水量、TUNEL阳性细胞数、Bax的表达均显著低于相应常温组，Bcl-2的表达显著高于常温组（P8。
关于再灌注期的局部亚低温延长再灌注时间窗及其脑保护的机制，本研究首先通过Bax、Bcl-2等指标从细胞凋亡角度进行了探讨。 体内和体外实验都表明bcl-2基因可抑制各种刺激下多种细胞的凋亡。对脑缺血导致的神经元凋亡也有很强的抑制作用。本研究显示亚低温可以增强脑缺血后bc1-2基因的表达，而这可能是减少脑梗死的细胞凋亡进而减少梗死体积的的一个重要原因。这与Li的等的研究结果相类似9。bax基因也是一种重要的凋亡调控因子，Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用，进而促进脑缺血后的细胞凋亡。本研究结果显示再灌注期实施亚低温能有效抑致Bax基因的表达，从而达到脑保护作用。这与Sahin等的研究结果相类似10。
故再灌注期实施亚低温增强Bcl-2基因的表达，有效抑致Bax基因的表达，从而有效抑制凋亡，这可能是亚低温延长再灌注时间窗及其脑保护的机制之一。
其次本研究对再灌注过程中血脑屏障的AQP4指标进行观察。血脑屏障的完整与否，直接影响到再灌注治疗的效果，它是制约再灌注时间窗长短的一个重要因素。AQP4作为水通道蛋白，在神经系统主要表达于构成血脑屏障重要部分的神经星形胶质细胞足突，它与再灌注过程中出现的水肿及继发出血转化有紧密的联系11。本研究结果表明亚低温可通过抑制AQP4表达从而减轻星形胶质细胞足突的水肿，进而加强内皮细胞的紧密连接，保护了血脑屏障，使再灌注治疗时间窗的延长成为可能。
再灌注期内实施局部亚低温可延长再灌注治疗时间窗，这可能与其增强Bcl-2表达抑制Bax、AQP4的表达从而抑制半暗带细胞的凋亡及其抑制AQP4的表达以保护了脑微循环有关。
参考文献
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