郑小娇，刘根炎，巨修练
(武汉工程大学 化工与制药学院，武汉 430205)
GABA (γ-aminobutyric acid)是哺乳动物中枢神经系统(central nervous system, CNS)内重要的抑制性神经递质。GABA从突触细胞释放后作用于GABA受体(γ-aminobutyric acid receptor)，激活离子通道打开使氯离子内流，从而对生物体的神经活动产生抑制作用。GABA受体是医药、兽药、农药的重要作用靶标，具有亚型多样性及作用位点复杂性的特点[1-3]。在哺乳动物中，根据受体结构和功能区分及药理特性，将GABA受体分为3种亚型：离子型通道GABAA受体、GABAC受体以及代谢型GABAB受体。GABAA受体属于半胱氨酸环配体门控离子通道超家族，是一种五聚体跨膜糖蛋白，与其他神经递质门控离子通道相似，GABA受体包含一个由5个跨膜亚基共同组装的中央氯离子通道孔[4-5]。研究表明，在哺乳动物中，GABAA受体由19种亚基(α1-6,β1-3,γ1-3,δ1,ε1,Φ1,π1,ρ1-3)组合而成[6]，每个亚基包含400~550个氨基酸残基，由3个结构域组成：约220个氨基酸残基组成的胞外N端配体结合区域(ligand-binding domain, LBD)，这部分为长链的亲水区，主要为折叠结构；
4个跨膜疏水序列(TM1-TM4)构成的跨膜区域(transmembrane domains, TMDs)，主要为螺旋结构，它们来回4次横穿细胞膜，组成跨膜通道，其中TM2组成通道内壁；
另外，还有处于细胞内基质的环，它是各亚基变异度最大的区域，目前对这部分序列的结构和功能研究较少[2]。
不同于哺乳动物，昆虫GABA受体目前并无GABAA、GABAB、GABAC受体3种亚型之分，一般认为昆虫GABA受体与哺乳动物的GABAA受体相似度较高[7]。对昆虫GABA受体的研究远不及哺乳动物GABAA受体，迄今为止，昆虫离子型GABA受体仅通过克隆得到3种亚基：RDL (Resistance to dieldrin)、GDR (GABA and glycine-like receptor ofDrosophila melanogaster)和LCCH3 (Ligand-gated Chloride Channel Homologue 3)。其中，RDL亚基因对狄氏剂具有抗性而得名，研究表明，目前仅发现RDL亚基能形成功能性门控氯离子通道[8-10]。与哺乳动物GABAA受体相比，RDL氨基酸序列具有高度的相似性，RDL亚基的TM3和TM4之间的连接片段较长，但同样具有跨膜疏水区，其结构与GABAA受体亚基相似。2004年Miller等首次报道了由5个β3亚基组成的人GABAA受体同源五聚体的三维晶体结构，对GABAA受体的研究具有划时代的意义，随后有关人的几种GABAA受体也被相继解析出来。但目前还没有昆虫GABA受体晶体结构被解析的报道[11-12]。
GABA受体调节剂(modulator)分为激动剂(agonist)和拮抗剂(antagonist)，拮抗剂又分为竞争性拮抗剂(comparative agonist, CA)及非竞争性拮抗剂(nocomparative agonist, NCA)。目前作用于GABA受体作为杀寄生虫的药物主要分为4类：⑴ 多氯环烷烃，其中代表品种为林丹(lindane)；
⑵ 苯基吡唑类，其中代表品种为氟虫腈(fipronil)；
⑶ 大环类酯，其中代表品种为伊维菌素(evermectin)；
⑷ 异噁唑啉类，其中代表品种为氟雷拉纳(fluralaner)。现将这4类杀寄生虫药物分别予以介绍。
图1 GABA受体及配体结合位点示意图
多氯环烷烃作为杀虫剂具有较长的历史。1825年Farady发现苯和氯气在日光下反应可以得到一种固体产物六氯环己烷，由于分子结构为C6H6Cl6简称为六六六。1912年Lindene指出，在六六六混合物中存在4种立体异构体。直到1935年六六六的杀虫活性才由Bender发现。随后Dupire和Slade也各自发现了六六六的杀虫活性。Slade还进一步指出，六六六的生物活性几乎完全是由于γ-六六六异构体的存在所引起的。含γ-体99%以上的六六六就叫林丹(lindane)，其具有触杀和胃毒杀虫作用，也有一定的熏蒸作用。在此基础上，20世纪50-60年代先后开发上市的杀虫剂有艾氏剂、狄氏剂、毒杀分、硫丹等多氯环烷烃类(图2)。1982年Matsumura等通过同位素示踪方法发现该类杀虫剂作用于GABA受体的NCA作用位点，这是世界上首次报道该类杀虫剂作用靶标为GABA受体[13-14]。该类杀虫剂对土栖害虫、植食性害虫、卫生害虫及一些动物寄生虫均有效，20世纪60-70年代在我国得到广泛应用，由于其在环境中不易降解及蓄积毒性，现已被禁止作为农药及兽药使用。该类杀虫剂作用于GABA受体的NCA结合位点，该位点位于GABA受体离子通道跨膜段M2区域，为区别于其他NCA结合位点，称为NCA-Ⅰ位点[15]。
图2 代表性多氯环烷烃分子结构
苯基吡唑类杀虫剂是20世纪80年代罗纳-普朗克公司在开发除草剂的过程中开发出的一类新颖结构的杀虫剂，代表品种有氟虫腈(fipronil)、乙硫虫腈(ethiprole)等。氟虫腈是由罗纳-普朗克农化公司于1987年研制开发，并于1993年开始商品化在全球范围内推广使用。它是一种高效、低毒的杀虫剂，也是第1个上市的苯基吡唑类杀虫剂，对哺乳动物和昆虫具有较高的特异选择性。通过同位素示踪及电生理等方法确认该类杀虫剂作用于GABA受体的NCA-Ⅰ位点，与多氯环烷烃类杀虫剂作用位点一致，两类杀虫剂具有交互抗性[16]。其后，陆续有苯基吡唑类杀虫剂被推向市场，如具有与锐劲特相类似的化学结构的乙虫腈，吡唑环4位为乙基亚砜，是安万特公司开发的杀虫、杀螨剂，其生物活性与氟虫腈相近，但生产成本低于氟虫腈，安全性高于氟虫腈。1996年Frontline (福来恩，fipronil)作为宠物用药在美国上市，适用于宠物各阶段的跳蚤虫卵、幼虫、成虫，虱子以及蜱虫，也可有效预防包括Lyme在内的多种疾病[17]，目前作为杀寄生虫药物大量使用。
图3 苯基吡唑类杀虫剂氟虫腈和乙虫腈
阿维菌素从首次被发现至今已经有近半个世纪的历史。1976年，科学家在日本静冈县意外发现了链霉菌(Streptomycesa vermitilisMA-4860)，在此之后不久美国默克公司(Merck)则在Streptomycesa vermitilisMA-4860的发酵菌丝内发现了8种天然大环内酯类同系物[18-19]。该公司将此类化合物定名阿维菌素(avermectin)，但其中活性最高的是阿维菌素B1a，又称abamectin或简称AVM。默克公司在1981年向市场推出了商品化的阿维菌素。阿维菌素类化合物主要由以下结构组成：主体结构十六元内酯环，以及与环连接的二糖基、六氢苯并呋喃环系和螺缩酮系等[20-21]。自从阿维菌素问世后，鉴于其抗虫谱广、杀虫活性高、对哺乳动物安全性高等优点，受到了全球药物科研人员的追捧，该发明获得2015年的诺贝尔生理学或医学奖。迄今为止，人类基于天然阿维菌素母体结构改造得到了安全、高效的阿维菌素衍生物，其中不乏成功案例，诸如生物活性较高的有伊维菌素(ivermectin, IVM)，目前作为医药及兽药使用得到广泛应用[22-23]。研究表明，阿维菌素作为GABA受体调节剂作用于该受体氯离子通道的亚基疏水段M1与M2或M3的交界区域，对GABA受体具有双向调节作用，低浓度刺激氯离子内流，高浓度阻滞氯离子内流。阿维菌素作用位点与目前发现的杀虫剂其他作用位点没有交互抗性[24]。阿维菌素的衍生物仍在不断开发中，甲胺基阿维菌素苯甲酸盐在农业害虫防治中得到了广泛应用。
图4 大环内酯类杀虫剂阿维菌素和伊维菌素
2004年，日本日产化学工业株式会社首次合成氟雷拉纳，该化合物属于异噁唑啉类，并于2005年获得国际专利授权[25]。研究表明该类杀虫剂作为GABA受体非竞争性拮抗剂作用于GABA受体的NCA-Ⅱ位点，NCA-Ⅱ位点可能位于GABA受体跨膜段亚基M1和M3的连接区域，因此该类杀虫剂与多氯环烷烃类及苯基吡唑类杀虫剂(作用于NCA-Ⅰ作用位点)没有交互抗性。目前其作用机制和结合位点仍在研究中[26-27]。Ozoe等人发现化合物氟雷拉纳不仅可作用于昆虫GABA受体也作用于谷氨酸氯门控离子通道，但其对GABA受体的抑制作用比对谷氨酸氯离子通道的更强[28]。氟雷拉纳是一种对寄生虫比较高效的GABA受体NCAs，为全身性抗寄生虫药，驱杀犬体表的跳蚤和蜱的作用可持续12周，并表现出比氟虫腈更高效的特点[29]。该剂于2014年1月首次在欧盟注册，并于同年4月上市，目前商品化产品Bravecto已在欧洲、美洲市场投入使用。在氟雷拉纳的结构基础上，先后开发了阿福拉纳、沙罗拉纳、洛替拉纳，并均已成功上市，用于宠物寄生虫的防治[30-32]。目前，氟雷拉纳已在超过85个国家注册，销售量超过1亿片，在全球动物保健产品中销量排名第一。该类化合物在农业上的应用正在研究中，具有较大的发展潜力。
图5 异噁唑啉类杀虫剂氟雷拉纳、阿福拉纳、沙罗拉纳、洛替拉纳
目前发现作用于GABA受体的杀寄生虫的药剂有3个作用位点，分别为：NCA-Ⅰ、NCA-Ⅱ及阿维菌素作用位点。作用于NCA-Ⅰ位点的药剂主要包括环戊二烯类、多氯环烷烃类、苯基吡唑类，作为兽药代表品种有林丹、氟虫腈等；
作用于NCA-Ⅱ位点的主要品种有氟雷拉纳、阿福拉纳、沙罗拉纳、洛替拉纳。作用于阿维菌素作用位点的大环内酯类化合物代表品种有伊维菌素，仍在广泛应用。另外，以溴虫氟苯双酰胺(broflanilide)为代表的结构新颖的间二酰胺类化合物与异噁唑啉类化合物均表现较好的杀虫活性且作用于GABA受体同一位点NCA-Ⅱ[33-34]，它们已在农业上推广应用[35]，2021年在我国上市。该类化合物也具有开发为杀寄生虫药物的潜力。GABA受体具有亚型多样性及配体结合位点多样性的特点，是研发杀虫剂及其作用位点的良好选择。