余悦华，梁桓熙，辛雨濛，孙震晓
(北京中医药大学生命科学学院，北京 102488)
胃癌是消化道常见恶性肿瘤，在我国癌症发病率中高居第2 位，死亡率排第3 位，严重危害人类健康[1]。目前治疗措施主要有手术治疗、放化疗和靶向治疗等，但对于晚期胃癌患者治疗措施有限，且往往不良反应严重[2-3]。
甘草干姜汤(licorice and dried ginger decoction，LDGD)源自张仲景的《伤寒杂病论》，由甘草和干姜以2∶1的比例混合煎煮而成，是《伤寒论》中精简小方的典型代表[4]。在临床上，有学者应用甘草干姜汤治疗寒性胃脘痛28 例[5]。甘草对乳腺癌细胞、艾氏腹水肿瘤、尤利希肿瘤、子宫内膜癌和其他恶性肿瘤的生长和增殖具有显著影响[6]。张明发等[7]研究发现，在使用干姜治疗晚期癌症患者的癌性疼痛时，干姜可以起到提高癌症患者生活质量的作用。
中药含药血清是指根据实验设计的需要用中药(单味或复方)按照一定的剂量、规定的剂型(大多用中药煎汤)和预定的给药次数、给药时间等对特定的动物如大鼠、小鼠、豚鼠和兔等进行灌胃后，选择适宜的采血法在拟定的时间内采集动物的血液并对其进行分离，最后得到的含有药物本身、药物代谢产物、活性成分、杂质成分和一定酸碱度变化等的血清复合 物[8]。与中药提取物相比，含药血清一定程度上代表了中药体内代谢后药物的作用，本实验选取人胃腺癌细胞AGS 和人脐静脉血管内皮细胞HUVEC，体外考察甘草、干姜和甘草干姜汤含药血清对两个细胞系的作用，初步考察其对肿瘤细胞和正常内皮细胞的区别。
针对中药多成分、多靶点、多途径的特点，网络药理学可以将中药有效成分作用于人体的靶向过程及有关蛋白质借助网络数据通过量与质的有效积累进行模拟和研究[9]，为进一步实验研究提供思路。本研究拟通过网络药理学探讨LDGD 抗胃癌的作用靶点和通路，并通过分子对接技术考察文献报道的LDGD中8种药效成分(甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚)[10]与甘草干姜汤抗胃癌关键靶点的结合情况，系统分析“疾病-基因-靶点-药物”关系，为后续实验研究和应用开发提供依据。
1.1 材 料
1.1.1 细胞株人胃腺癌细胞AGS、人脐静脉血管内皮细胞HUVEC 购自中国医学科学院基础医学研究所细胞库，由北京中医药大学生命科学学院生物制药系冻存。
1.1.2 动物20 只SD 雄性大鼠购于北京斯贝福公司，合格证号SCXK(京)2019-0010。
1.1.3 药物甘草、干姜饮片购自安国市昌达中药材饮片有限公司(甘草批号1801001，干姜批号1806001)。
1.1.4 主要实验试剂RPMI-1640 培养基购自美国Gibco 公司；
胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。DMSO购自Sigma公司；
青霉素、链霉素溶液、四甲基噻唑蓝(MTT)均购自Amresco公司；
胰蛋白酶购自北京拜尔迪生物科技有限公司。乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)购自Ameresco 公司，氯化钠(NaCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氢氧化钠(NaOH)均购自北京化学试剂公司。
1.2 方 法
1.2.1 甘草、干姜及甘草干姜汤提取物的制备将中药药材与10倍于药材质量的纯水使用加热回流的方式进行提取，从微沸时开始计时，2 h 后转移药液，再加入8 倍于质量的纯水进行提取，再次微沸时开始计时，1.5 h后与之前药液合并，离心除渣后利用旋转蒸发仪浓缩，将浓缩后的药液置于-80 ℃预冻，过夜后使用冻干机进行冻干，冻干48 h，得到中药冻干粉。根据最后所得冻干粉的质量和生药量来计算冻干粉得率。
1.2.2 LDGD 含药血清的制备取健康SD(体质量180~190 g)大鼠20只，按体质量随机分为给药组和空白对照组，给药组分为甘草组、干姜组、甘草：干姜不同配比(分别为2∶1、1∶1、1∶2)的甘草干姜汤组，按照每次4.5 g/kg(相当于人临床剂量的30倍)进行给药，每只大鼠每次灌胃2 mL，每天早晚各两次，空白对照组灌胃等量的蒸馏水。连续灌胃3 d，第3天给药后禁食。第4 天末次给药1 h 后，使用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，将血液静置40 min 后3 000 r/min 离心15 min。将每组血清混匀，在56 ℃水浴锅中温育30 min进行灭活，用0.22 μm过滤除菌后分装保存于-20 ℃。用时将含药血清加入到无血清培养基中稀释至所需浓度进行实验，同时设相同稀释倍数对照组大鼠血清为含药血清实验溶剂对照组。
1.2.3 LDGD含药血清的抗肿瘤作用实验取对数生长期的细胞，以每孔1 000 个接种于96 孔板，每孔100 μL，CO2体积分数5%、37 ℃培养箱中孵育24 h。待细胞贴壁生长良好，加入含有含药血清的RPMI-1640培养基150 μL，甘草、干姜、甘草干姜汤提取物均设10%、20%、30%等3个浓度，空白对照组为含10%、20%、30%空白大鼠血清的1640 培养基，CO2体积分数5%、37 ℃条件下培养24、48 h。去除培养基，每孔加入0.5 mg/mL 的MTT 100 μL，继续孵育4 h，吸去培养液，加入DMSO 150 μL充分溶解深蓝色甲瓒结晶，酶标仪570 nm测吸光度D(570)。
1.2.4 甘草干姜汤化学成分收集及药物靶点预测利用中药系统网络药理学数据库TCMSP[11](http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，通过设置筛选条件为口服生物利用度(oral bioavailability，OB)30%、类药性指数(drug-like properties，DL)≥0.18[12]，筛选甘草、干姜的有效化学成分并获取其相关靶点；
另外通过文献调研，将不符合类药筛选但在甘草、干姜中含量高或具有良好抗肿瘤活性的成分纳入成分集。
利用数据库Genecards[13](https://www.genecards.org/)，以“gastric cancer”为关键词筛选，获取人胃癌相关的靶点，选择Relevance score＞30 的人胃癌相关靶点。
应用R 语言中的在线程序Draw Venn Diagrams 对获取到的甘草干姜汤药物靶点与胃癌靶点取交集靶点，作为甘草干姜汤抗胃癌的潜在作用靶点。
1.2.5 “成分-靶点”网络图构建将甘草干姜汤抗胃癌的潜在作用靶点导入到Cytoscape 3.8.0 中，构建成分-靶点相互作用网络并进行分析，以Degree 作为评价节点在网络中重要性的标准。
1.2.6 PPI 网络构建及LDGD 抗胃癌关键靶点的筛选将交集靶点导入String数据库(https://string-db.org/)构建PPI 功能蛋白作用网络，并利用Cytoscape 3.8.0中的CytoNCA插件进行网络分析。
1.2.7 GO 功能和KEGG 信号通路富集分析利用R语言中的软件包Bioconductor(https://www.bioconductor.org/)对交集靶点的细胞成分、分子功能、生物学过程以及信号通路进行富集分析。首先将基因Symbol转化为基因ID，选择物种为人(Homo spanies)，设定阈值为P＜0.05，输出富集结果并绘制条形图与气泡图。
1.2.8 分子对接利用Discovery Studio 2.5 中的LibDock 将PPI 结果中排名靠前的抗胃癌关键靶点与LDGD 中的8 种药效活性成分(甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚)进行分子对接，来探究LDGD中的药效成分是否能与关键靶点结合从而发挥抗胃癌作用。
为验证初步定义的活性位点参数的正确性及可重复性，取出原配体，再利用分子对接程序重新将原配体对接进入初步定义的活性位点，采用计算均方根偏差(root-mean-square deviation，RMSD)作为评价活性位点准确性的参数，以原配体打分值的80%设为阈值，将打分值高于阈值且相互作用模式与原配体相似的筛选化合物定义为潜在的活性化合物[14-15]。其中，VEGFA没有含抑制剂原配体的蛋白晶体结构，故选取VEGFA 抑制剂哌加他尼(Pegaptanib)[16]与VEGFA 对接，将8 种药效成分的对接结果与抑制剂哌加他尼的对接结果进行比较。
1.2.9 数据处理及统计学分析实验数据采用SPSS 24 和Graphpad prism7 软件进行统计学分析，用xˉ±s表示，使用单因素方差分析对多样本均数进行比较，使用t检验对两样本均数进行比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 血清药理学实验结果
实验结果见图1、2，LDGD 含药血清对人胃腺癌细胞AGS有显著的抑制作用；
而含药血清对人脐静脉血管内皮细胞HUVEC 无明显抑制作用；
并且单味药给药的抑制效果远小于复方给药效果。
图1 甘草、干姜及甘草干姜汤大鼠含药血清对人胃腺癌细胞AGS活力的影响
2.2 甘草干姜汤的化学成分及靶点
通过TCMSP 数据库共收集甘草干姜汤中101个化学成分，将化合物的靶点进行合并去重处理后，共得到LDGD 成分对应的靶点220 个，通过对数据库检索获得胃癌相关靶点549 个，两者的交集靶点作为LDGD的潜在抗胃癌靶点共94个，结果如图3所示。
图3 LDGD化学成分相关靶点和胃癌相关靶点的Veen图
2.3 构建成分-靶点网络图
运用Cytoscape 3.8.0中的Import Network插件构建甘草干姜汤化学成分-靶点作用网络，如图4所示。基因靶标为方形；
化学成分为圆形，其中甘草成分为绿色，干姜成分为红色。
图4 LDGD化学成分及其相关靶点的作用网络图
图2 甘草、干姜及甘草干姜汤大鼠含药血清对人脐静脉血管内皮细胞HUVEC活力的影响
2.4 PPI网络的构建及LDGD抗胃癌关键靶点的筛选
LDGD 的潜在抗胃癌靶点构建的PPI 如图5 所示，进行网络拓扑分析，筛选网络中的关键节点。LDGD抗胃癌核心靶点筛选规则：介度中心性(betweenness centrality)，紧密中心性(closeness centrality)，节度中心 性(degree centrality)， 特 征 向 量(eigenvector centrality)，局部连通性(local average connectivitybased method lac)，各组数值中大于本组中位值的基因予以保留，按照Degree数值进行排序，筛选出的20个LDGD 抗胃癌核心靶点结果如表1 所示。按上述规则重复筛选3 次，得到LDGD 抗胃癌的关键靶点为VEGFA、TNF-α、CASP3、MYC，如图6所示。
图6 LDGD抗胃癌关键靶点的筛选
表1 LDGD抗胃癌核心靶点拓扑分析结果
图5 LDGD抗胃癌潜在靶点的PPI网络图
2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
对LDGD 潜在抗胃癌靶点进行GO 功能富集分析，如图7所示，细胞成分44个，主要有细胞周期蛋白依赖性激酶、膜筏、膜微区、膜区等。生物学过程2 227 个，主要有对氧化应激、凋亡信号通路、活性氧、金属离子、脂多糖的调节等。分子功能135 个，主要有泛素样蛋白连接酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、RNA 聚合酶II 转录因子结合、四吡咯结合、蛋白磷酸酶结合、血红素结合、泛素蛋白连接酶结合、细胞因子受体结合等。
图7 LDGD潜在抗胃癌靶点的GO功能富集分析
对LDGD 潜在抗胃癌靶点进行KEGG 通路富集分析，结果如图8 所示，横坐标表示富集到基因的数量，左边表示通路名称，颜色表示P值，P值越小颜色越偏向红色，P值越大则越偏向蓝色。LDGD 抗胃癌机制主要涉及TNF 信号通路、p53 信号通路、细胞凋亡等。
图8 LDGD潜在抗胃癌靶点的KEGG通路富集图
2.6 分子对接结果
LDGD 的8 种药效成分(甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚)与抗胃癌的关键靶点(VEGFA、TNF-α)的对接结果如表2所示，结合方式如图9、10所示。
图9 LDGD 8种药效成分和VEGFA的对接结果
表2 对接结果
所有分子均能与VEGFA 对接成功，其中8-姜酚、甘草酸、甘草苷对接分数均高于阈值(哌加他尼对接分数的80%)。其中6种小分子与TNF-α的对接分数均高于阈值(原配体对接分数的80%)。甘草酸、甘草苷、6-姜酚与两个关键靶点的对接分数较高、亲和力较强，且甘草酸、甘草苷、6-姜酚在甘草干姜汤中的含量较高，推测其可能是甘草干姜汤中抗胃癌的关键药效成分。
图10 LDGD 6种小分子药效成分和TNF-α的对接结果
本研究通过血清药理学初步探究了甘草干姜汤的体外抗肿瘤活性，发现其对人胃腺癌细胞AGS有显著的抑制作用，而对人脐静脉血管内皮细胞HUVEC 无明显抑制作用，对两者作用有区别。通过网络药理学预测了甘草干姜汤抗胃癌的关键靶点为VEGFA、CASP3、MYC、TNF-α，可能通过对凋亡信号、氧化应激、活性氧的调节等途径发挥抗胃癌作用，通过激活TNF、p53 等信号通路来抑制胃癌细胞增殖；
文献报道的LDGD 中8 种主要成分与抗胃癌关键靶点VEGFA、TNF-α的分子对接结果提示甘草酸、甘草苷、6-姜酚可能为LDGD抗胃癌的关键药效成分。
肿瘤的发生通常伴随着炎症反应，适当针对TNF-α开发抑制剂可能是一种新的治疗肿瘤的方式，但仍需要进一步的探索[17]。TNF-α高表达与胃癌的分期、分化程度、淋巴结转移密切相关，可参与胃癌病症的发生、进展[18]。VEGFA由内皮细胞以及肿瘤等多种细胞分泌，其最初被证明是一种内皮生长因子以及血管通透性的调节因子[19-20]。VEGFA 是实体瘤生长过程中血管生成的关键性调节因子，研究发现VEGFA/VEGFR2 信号通路的激活会促进胰腺导管腺癌的侵袭、迁移和血管生成[21]。靶向VEGFA的治疗方案成为了肿瘤学的创新性治疗方法。而分子对接结果表明LDGD 中可能含有抑制VEGFA、TNF-α的药效成分，提示LDGD 可能通过抑制VEGFA、TNF-α来发挥抗胃癌作用。
综上所述，本研究发现甘草干姜汤具有一定的抗胃癌作用，并初步探讨甘草干姜汤潜在的抗胃癌作用机制，为甘草干姜汤的抗胃癌研究提供了一定参考。受网络药理学和分子对接自身性质的限制，及甘草干姜汤药效成分研究的不足，关于其抗胃癌的机制需要更进一步研究。
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