程玉林,李国英*
（1.四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川成都 610065；
2.四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室，四川 成都 610065）
胶原水凝胶具有良好的生物相容性、低免疫原性和可生物降解性，且胶原分子含有特定的氨基酸残基和序列能促进细胞的粘附和生长，因此广泛应用于生物医学领域[1-3]。胶原水凝胶的制备通常是用5 mg/mL 胶原溶液在37 ℃下培养3 h 自组装成胶，且据文献报道[4]，在1 Hz 时储能模量仅90.57 Pa，损耗模量仅12.25 Pa。胶原水凝胶所需成胶时间过长，还存在机械性能不足的问题，极大的限制了胶原水凝胶的临床应用潜力。
光固化具有无溶剂、快速节能和条件温和的优点[5]，且可对水凝胶的形成过程进行控制，开发性能和结构皆可调节的水凝胶[6]。目前制备胶原基光固化水凝胶多使用丙烯酸类修饰胶原，如Ke Yang 等[7]通过胶原甲基丙烯酰胺制备光固化水凝胶并用于软骨再生。但丙烯酸只能从石油化工原料中获得，具有刺激性和过敏性[8]，还有一定的毒性[9]。
衣康酸是含有一个碳碳不饱和双键的二元酸，且可通过真菌发酵获得[10]，是一种光固化材料中丙烯酸的生物基替代品[11]，主要在添加剂和橡胶涂层等领域，用于制备生物基助剂[12]和开发环保光固化涂料[13]，衣康酸制备光固化水凝胶的报道尚很欠缺。在哺乳动物体内，衣康酸是抗菌代谢物和免疫细胞代谢调节物[14-15]，具有生物相容性、可生物降解性、抗菌性[16]、抗炎性[17-18]和药物缓释能力[19]。这些优异的生物性能标示着衣康酸在生物医药领域有巨大的潜力。S.Potorac 等人[20]制备了单衣康酸基团的改性胶原，并添加N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和过硫酸铵与甲基丙烯酸2-羟乙酯共聚24 h 制备了半互穿网络，并指出该支架可用于组织工程，反应所用交联剂毒性较大，耗时长。鉴于此，本文拟用衣康酸改性胶原并通过光固化快速制备水凝胶。
由于酸酐反应活性更高，本工作选用衣康酸酐改性胶原，通过具有细胞相容性的光引发剂引发碳碳双键的自由基聚合[21-22]，使聚合物溶解度降低，并形成网孔结构，最终丧失流动性而形成凝胶[23-24]，成胶示意图如图1。制备了不同取代度形成的光固化水凝胶以探究取代度对光固化凝胶性能的影响，并根据其性能评价了光固化水凝胶在伤口敷料中的潜在应用前景，且为实现光固化凝胶性能的可调控性奠定基础。
图1 光固化水凝胶形成机理Fig.1 Schematic of the photocurable hydrogel formation
1.1 实验仪器和材料
冻干牛皮胶原，实验室自制；
衣康酸酐（98%+），阿达玛斯试剂有限公司；
三硝基苯磺酸（TNBS），Sigma 公司；
Irgacure 2959（98%），Aldrich 化学试剂公司；
营养琼脂，北京奥博星生物技术有限公司；
琼脂粉，成都金山化学试剂有限公司。
TU-1900 双光束紫外可见分光光度计，普析通用仪器有限责任公司；
Nicolet iS10 傅里叶红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；
MCR 流变仪，安东帕公司；
FD-1A-50 冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司。
1.2 胶原的改性
称取1.5 g 胶原溶解于500 mL 的磷酸缓冲液（pH 值7.4），加入10 mL 衣康酸酐丙酮溶液在0～10℃下持续搅拌24 h 后，用截留相对分子质量为8～14 KD 的透析袋在去离子中水透析三天后冷冻干燥得到可光固化胶原。其中，胶原分子的自由氨基（牛皮胶原每1000 个氨基残基含33 个赖氨酸和羟赖氨酸残基[25]）与衣康酸酐物质的量比分别为1∶10、1∶30、1∶50、1∶70 和1∶90，制备得到的样品依次记为A、B、C、D 和E。
1.3 可光固化胶原的表征
1.3.1 取代度测定
通过三硝基苯磺酸（TNBS）法[26]测定胶原游离氨基的取代程度，具体方法为：将牛皮胶原与可光固化胶原分别溶解在0.01 mol/L 的盐酸溶液中配置为2 mg/mL 的溶液，取250 μL 入消解管，加入1 mL磷酸缓冲液（pH 值为8），避光加入1 mL 0.1%的TNBS 溶液，摇晃均匀后在50 ℃暗反应30 min。反应结束后加入2 mL 4 mol/L 的HCl 溶液，置于暗处，冷却30 min 后测定混合液在340 nm 处吸光度（OD），并根据以下公式计算自由氨基含量：
自由氨基含量=OD可光固化胶原/OD牛皮胶原×100%
1.3.2 傅里叶红外光谱测定
为测定可光固化胶原的结构，将冻干的牛皮胶原和可光固化胶原海绵分别与溴化钾研磨均匀并压成薄片，用傅里叶红外光谱仪在400～4000 cm-1范围内进行扫描，扫描次数32 次。
1.4 光固化凝胶的制备
以磷酸缓冲液（pH 值7.4）为溶剂，可光固化胶原质量浓度10 mg/mL，并加入0.2%的Irgacure 2959，充分溶解后离心脱泡得到预制液。分别称取A～E 样品预制液2 g 于24 孔板（孔直径为2 cm）中，用紫外光（6 W，365 nm）照射3 min 得到光固化水凝胶，分 别 标 记 为Gel-A、Gel-B、Gel-C、Gel-D 和Gel-E。
1.5 凝胶的成胶能力与凝胶形貌测定
1.5.1 胶凝时间测定
称取1 g 凝胶预制液于3 mL 取样瓶中，置于紫外光源下照射，利用倾斜法测定并记录不同官能化程度的可光固化胶原样品的凝胶时间。
1.5.2 凝胶的形貌观察
将冻干后的光固化水凝胶喷金处理后，在加速电压20 kV 下通过电子显微镜观察样品的形貌。
1.6 凝胶的流变测量
使用流变仪测定水凝胶的机械性能，将待测水凝胶放至流变仪的不锈钢平行板（直径20 cm）上，设置板间间隙2 mm，在温度为20 ℃，应变为2%的条件下，进行动态频率扫描，记录频率范围为0.01～10 Hz 的储能模量（G"）和损耗模量（G"""）。
1.7 凝胶的溶胀性能
水凝胶的溶胀比在37 ℃条件下测定，将冻干的凝胶海绵称重后浸泡在20 mL 磷酸缓冲液（pH值6.5），每2 h 对凝胶称量，直到凝胶重量不变，每个样品进行三个平行实验，并根据公式（1）计算溶胀度后取平均值：
溶胀度=W凝胶/W海绵-1 （1）
1.8 体外抗菌实验
选取金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）验证不同样品的抗菌特性，具体操作为：取10 μL 菌液（1×107cfu/mL）于营养琼脂平板上，涂布均匀，将水凝胶（高度=5 mm，直径=10 mm）紫外杀菌30 min 后放置在平板中央，在37 ℃恒温培养12 h后使用游标卡尺测量抑制区域直径。用未添加水凝胶的琼脂板作为空白对照组，且每个样品进行三次平行实验，并计算抑制区的平均直径。
2.1 酸酐用量对自由氨基含量的影响
衣康酸酐主要与胶原侧链上的ε- 氨基发生酰化反应[27]，氨基作为亲核基团进攻酸酐中羰基的碳原子形成酰胺键与羧基，而衣康酸酐分子中1 号与2 号碳原子存在p-Π 共轭，因此氨基更倾向于攻击4 号碳原子，主要反应原理见图1。图2 为自由氨基含量随衣康酸酐用量的变化关系。如图2 所示，样品A～E 的自由氨基含量分别89.5%、43.0%、29.6%、22.9%和17.2%，即其取代度分别为10.5%、57.0%、70.4%、77.1%和82.8%。随着衣康酸酐用量增加，自由氨基含量减少，直到自由氨基与衣康酸酐物质的量比为1∶50 自由氨基含量下降趋势明显减缓。因为受自由氨基总量限制，当衣康酸酐用量增加到一定程度后，能参加反应的自由氨基数量减少，自由氨基含量下降趋势减缓，这初步说明成功在胶原侧链上接枝了衣康酸基团。
图2 牛皮胶原（Col）与可光固化胶原（A、B、C、D 和E）自由氨基含量Fig.2 Free amino content of bovine collagen (Col) and photocurable collagen (A, B, C, D and E)
2.2 可光固化胶原的红外光谱分析
红外光谱中酰胺Ⅲ带与1450 cm-1处的吸收率（A）比值可评价胶原三股螺旋结构完整性[28-29]，明胶的比值仅为0.59，而胶原的比值远高于明胶[30]。牛皮胶原及可光固化胶原的红外光谱图如图3，Col 与A～E 的A 酰 胺Ⅲ/A1450 值 依 次 为0.996、0.806、0.821、0.863、0.863 和0.875，比值均大于0.59，说明可光固化胶原保留了一定程度的三股螺旋结构。相比于牛皮胶原红外光谱，官能化胶原的光谱在3432 cm-1附近的吸收峰发生略微红移，且波峰变宽，这是因为衣康酸酐消耗了氨基，生成了酰胺键，故而氨基中伯胺中N-H 的伸缩震动（3440 cm-1附近）减弱，而仲酰胺N-H 伸缩震动（3300 cm-1附近）增强；
同时，1405 cm-1处峰吸收强度明显增加，这归因于CH2=CR1R2结构中C-H 键的弯曲振动[31]。红外图谱的这些变化进一步证明衣康酸酐成功的接枝到胶原上，得到了可光固化胶原。
图3 牛皮胶原与可光固化胶原的红外光谱图Fig.3 IR spectra of Col and photocurable collagen
2.3 光固化凝胶的成胶能力与形态表征
多孔结构敷料非常有利于吸收分泌物和保持水分，光固化凝胶的实物图与微观结构图如图4 所示，结果显示，所有样品都能在180 s 内快速成胶，Gel-A、Gel-B、Gel-C、Gel-D 和Gel-E 的平均孔径分别为1.25、1.12、0.89、0.74 和0.44 mm，可见，随着取代度增加，凝胶固化所需时间变长，同时凝胶孔径逐渐变小。因为逐渐凝胶化使链段移动性降低，只能与临近位点发生反应，且可光固化胶原分子内存在的大量游离羧基还会产生排斥而不利于固化反应[32]；
另一方面，羧基使可光固化胶原溶解度增加而难以形成凝胶。而取代度增加导致反应位点变多，凝胶的交联度变大从而获得了更小孔径也更致密的凝胶网络。因此，可以通过调节胶原与酸酐的比例来调整可光固化胶原的成胶能力与凝胶孔径结构。
图4 光固化凝胶的宏观照片（左）和放大倍数为20 的SEM图像（右）（对应可光固化胶原的取代度：Gel-A=10.5%；
Gel-B=57.0%；
Gel-C=70.4%；
Gel-D=77.1%；
Gel-E=82.8%，下同）Fig.4 Macro photos (left) and SEM images with magnification of 20 (right) of the photocurable hydrogel(corresponding substitution degree of photocurable collagen:GEL-A=10.5%;Gel-B=57.0%;GEL-C=70.4%,Gel-D=77.1%;gel-E=82.8%,the same below)
2.4 凝胶的力学性能
伤口敷料通常需要一定的强度和柔韧性，图5显示了光固化凝胶的动态流变测量曲线。储能模量和损耗模量分别反映了聚合物的弹性与粘性特性的耗散能量[33]。在频率低于1 Hz 时，每个样品的储能模量与损耗模量都变化不大，说明样品在0.01～1 Hz 范围内机械性能稳定；
同时储能模量明显大于损耗模量，说明样品具有弹性性质。相对于不同取代度可光固化胶原制备的光固化凝胶，其储能模量与损耗模量都先增加后减小，样品Gel-C 的储能模量与损耗模量最大，其抵抗形变与流动的能力最强。Gel-D 与Gel-E 的储能模量与弹性模量下降，主要是因为聚合物中羧基使其溶解度增加，交联固化作用小于溶解流动作用。
图5 光固化凝胶的力学性能（a）储能模量（G’）、（b）损耗模量（G’’）和（c）损耗角正切值（tanθ）与频率的函数Fig.5 Mechanical properties of photocurable hydrogel(a)Storage modulus(G"),(b)loss modulus(G")and(c)loss tangent(tan θ)as a function of frequency
频率为1 Hz 时凝胶的储能模量、损耗模量和损耗角正切值见表1。在1 Hz 时，Gel-C 的储能模量为358.07 Pa，损耗模量为45.93 Pa，分别为胶原水凝胶[4]的3.95 和3.75 倍。Gel-C 相对于Gel-A 的储能模量与弹性模量分别增加了1.80 与1.26 倍，储能模量变化大于弹性模量，说明光固化反应对于凝胶弹性影响更大。损耗角正切值（tanθ）为损耗模量与储能模量的比值，该值大于1时表示主要为粘性行为（类似于液体），该值小于1时主要为弹性行为（类似于固体）[34]，表1 中所有样品的损耗角正切值小于0.19，表明凝胶具有较好的弹性。在所有样品中，Gel-C 的tanθ数值最小，弹性最好且强度高，有利于保护伤口不受外力伤害。
表1 频率为1 Hz 时储能模量（G"）、损耗模量（G""）和损耗角正切（tanθ）的数值Tab.1 Values of storage modulus (G"), loss modulus (G"")and loss tangent (tanθ) at a frequency of 1 Hz
2.5 凝胶的溶胀分析
通常人类的体温为37 ℃，皮肤pH 值在6.5 左右，光固化凝胶在该条件下的溶胀情况如图6 所示。光固化凝胶的溶胀主要归因于羧基，羧基在pH值低于或高于等电点时分别呈正电和负电性，使凝胶快速吸水，但吸水至一定程度时会受到凝胶孔隙的制约，因而最终达到溶胀平衡。结果显示，所有凝胶在前期快速溶胀，且在溶胀4 h 后趋于平衡，不同交联度的凝胶溶胀性能先增加后减小。说明在一定取代度范围内，光固化凝胶的溶胀性随着衣康酸基团取代度升高而明显增加但交联过于致密反而会使溶胀性能降低。溶胀24 h 后，质量体积浓度5%的明胶甲基丙烯酰胺光交联水凝胶的溶胀率为15 左右[35-36]，而Gel-C 的溶胀率高达37.65，吸水能力强，有利于吸收伤口渗出液[37]。
图6 光固化凝胶在磷酸缓冲液中的溶胀情况（a）溶胀度与时间的曲线；
（b）凝胶24 h 后的溶胀度Fig.6 Swelling of photocured hydrogel in phosphate buffer(a)Curve of swelling degree versus time;(b)Swelling degree after 24 h
2.6 体外抗菌性能分析
伤口敷料需要具备一定的抗菌能力。阴离子聚合物杀菌机理是聚合物的负电荷趋使聚合物中疏水部分靠近细菌[38]，进而通过疏水作用扰动和破坏细胞膜而起到杀菌作用[39]。衣康酸基团使光固化凝胶具有阴电性，为验证其抗菌性能，测量了光固化凝胶的抑菌圈直径，结果如图7。光固化凝胶交联度越高，对金黄色葡萄球菌（S.aureus）抑菌圈直径越大，而凝胶对大肠杆菌（E.coli）未显示出抑制效果。因为抑菌效果与衣康酸含量呈正相关[40]，且S.aureus和E.coli 的细胞壁不同，E.coli 含外壁膜和肽聚糖内层，而S.aureus 的仅有多孔肽聚糖层，使疏水片段更容易插入[41]。
图7 光固化凝胶的抑菌圈直径Fig.7 Diameter of bacteriostatic zone of photocurable hydrogel
通过调节衣康酸基团的取代度，可以调节光固化凝胶性能：随着衣康酸基团取代度增加，光固化凝胶的交联度增加，孔径变小；
凝胶的储能模量和损耗模量与溶胀性随交联度增加先增加后减少，抗菌性与衣康酸基团含量呈正相关。综合性能最佳的光固化凝胶为Gel-C，此时凝胶自由氨基含量为29.6%（即取代度为70.4%），储能模量和损耗模量分别为358.07 Pa 和45.93 Pa，且溶胀率高达37.65。该光固化凝胶可快速成胶，且拥有高溶胀性和一定的抗菌性，有望用于制备伤口敷料。