李轶男，裴汉军，余学文
内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014010
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是常见严重的临床疾病，除对患者自身产生危害外，其高发病率也给医疗保健系统带来了巨大挑战[1]。许多学者指出AKI的发生、发展与线粒体自噬水平的高低密切相关[2-3]，线粒体自噬水平的增加可作为肾小管细胞在应激条件下的一种保护机制[4]。因此如何有效调控线粒体自噬水平、进而改善肾脏缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）已成为现阶段临床研究的重点及热点[5]。远隔缺血预处理（remote ischemic preconditioning，RIPC）是通过对器官或组织进行短暂、可逆的缺血再灌注处理，使靶器官能够抵抗氧化应激和致死性IRI的方法[6]。有研究[7]发现RIPC可诱导对肾脏IRI产生保护作用。因缺血再灌注是引起AKI的主要原因，故本实验构建急性肾IRI模型，进一步验证RIPC在AKI中的保护作用，并从线粒体自噬角度分析其作用机制。
1.1 实验动物
研究所用24只雄性C57BL/6小鼠购买于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。饲养在包头医学院动物房内，饲养条件：光暗循环12h、通风良好、温度21℃～25℃。定期更换垫料、喂食标准鼠粮及自来水。本研究的所有程序均获得内蒙古科技大学包头医学院实验动物伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 分组方法
将C57BL/6小鼠8～10周（体重20～25g）随机分为4组，每组6只。
（1）假手术组（Sham）：沿脊柱两旁肾区部位切开，暴露两侧肾脏，不做任何处理，维持1h后缝合创口，正常饲养23h。
（2）缺血再灌注（I/R）：暴露两侧肾脏，微型动脉夹夹闭双侧肾蒂，夹闭40min，再灌注1h后缝合创口，正常饲养23h。
（3）远隔缺血预处理组（RIPC）：橡皮筋结扎小鼠左后肢根部，缺血5min，再灌注5min，反复4个循环，之后的操作同I/R组。
（4）自噬抑制剂组（RIPC+3-MA）：在RIPC处理的基础上，经腹腔注射3-MA（30mg/kg，0.2mL/20g体重），2h后所有操作按I/R组进行。
1.2.2 模型制备
（1）IRI模型：用10%的水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉，待夹尾反射消失后，沿脊柱两旁肾区部位切开暴露肾脏，微型动脉夹夹闭双侧肾蒂40min，再灌注24h，构建IRI模型。
（2）RIPC模型：用10%的水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉，待夹尾反射消失后，用橡皮筋结扎小鼠左后肢根部，缺血5min，再灌注5min，反复4个循环，之后的操作同I/R组。
1.3 观察指标
1.3.1 血肌酐、尿素氮测定
使用全自动生化分析仪（美国雅培C16000），检测每组小鼠血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）浓度。
1.3.2 HE染色后观察肾小管损伤程度
HE染色法：石蜡切片经烤片、脱蜡、水化后，用苏木素、伊红染色，脱水、透明后观察。在肾皮质和髓质结合部及外髓采集10个连续视野，进行盲法半定量评分：无损伤（0分）、轻度损伤（＜25%，1分）、中度损伤（25%～50%，2分）、重度损伤（损伤面积51%～75%，3分）、极重度损伤（＞75%，记4分）。
1.3.3 线粒体自噬情况
免疫印迹法：取肾脏皮质和髓质交界区组织，提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度，随后经电泳、转膜、封闭、一抗（LC3A/B、Beclin1）4℃过夜孵育、二抗孵育、显色等步骤，观察LC3A/B、Beclin1的表达。
免疫组织化学法：将制备好的石蜡切片经脱蜡和水化、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断剂孵育、一抗（p62）4℃过夜孵育、二抗孵育、DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、封片等步骤后，在显微镜下观察p62的表达情况。
免疫荧光双标法：将制备好的石蜡切片经脱蜡和水化、抗原修复、3%双氧水孵育、5%BSA封闭、一抗混合工作液（TOMM20、LAMP2、LC3A/B）4℃过夜孵育、荧光二抗混合工作液（山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗1）37℃避光孵育、DAPI染色、水溶性封片剂封片等步骤后，在荧光显微镜下观察其定位情况。
1.4 统计学方法
用SPSS 23.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），方差齐采用LSD检验，方差不齐采用Dunnetts T3检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。
2.1 四组小鼠血Scr、BUN水平比较
与Sham组比较，其余各组Scr、BUN浓度均增加（P＜0.05）。与I/R组比较，RIPC组Scr、BUN浓度均降低（P＜0.05）。与RIPC组相比，RIPC+3-MA组Scr、BUN浓度增加（P＜0.05），见表1。
表1 三组小鼠SCr、BUN 比较（）
表1 三组小鼠SCr、BUN 比较（）
注：*P＜0.05vs Sham group；
#P＜0.05vs I/R group；
△P＜0.05vs RIPC group。
2.2 四组小鼠肾小管损伤情况比较
与Sham组比较，其余各组肾小管损伤半定量损伤评分均增加（P＜0.05），与I/R组比较，RIPC组肾小管损伤半定量评分降低（P＜0.05）。与RIPC组相比，RIPC+3-MA组肾小管损伤半定量评分增加（P＜0.05），见图1。
图1 各组肾组织肾小管损伤半定量评分比较
2.3 四组小鼠线粒体自噬情况比较
免疫印迹法示：与Sham组相比，I/R组、RIPC组LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白的表达水平明显增加（P＜0.05）。与I/R组相比，RIPC组LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白的表达水平增加（P＜0.05）。与RIPC组相比，RIPC+3-MA组LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白的表达水平减低（P＜0.05），见图2。
图2 免疫印迹法检测各组肾组织LC3A/B、Beclin1 蛋白半定量分析
免疫组化示：与Sham组相比，其余三组p62蛋白的光密度值降低（P＜0.05）。与I/R组相比，RIPC组p62蛋白的光密度值降低（P＜0.05）。与RIPC+3-MA组相比，RIPC组p62蛋白的光密度值降低（P＜0.05），见图3。
图3 免疫组织化学法各组肾组织p62 蛋白平均光密度值比较
免疫荧光双标共定位结果示：与Sham组相比，各组肾组织线粒体外膜转位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOMM20）与LC3A/B、TOMM20与溶酶体相关膜蛋白2（lysosome-associated membrane protein-2，LAMP2）共定位面积百分比明显增加（P＜0.05）。与I/R组相比，RIPC组肾组织TOMM20和LC3A/B及TOMM20和LAMP2共定位面积百分比增加（P＜0.05）。与RIPC组相比，RIPC+3-MA组肾组织TOMM20和LC3A/B及TOMM20和LAMP2共定位面积百分比降低（P＜0.05），见图4、图5。
图4 免疫荧光双标各组肾组织TOMM20 与LC3A/B 共定位面积百分比比较
图5 免疫荧光双标各组肾组织TOMM20 与LAMP2 共定位面积百分比比较
目前临床尚缺乏预防AKI的有效方法。RIPC是在致伤因素作用于靶器官之前，通过对远隔组织（如四肢动脉）或器官血供短暂阻断后恢复灌注，以期保护靶器官的治疗方法。该技术最早被用于减轻心肌组织的缺血再灌注损伤，其可减小由冠状动脉长时间闭塞导致的心肌梗死的面积[8]。随后的研究发现RIPC的保护作用同样存在于除心脏之外的其他器官，例如肾脏[9]，但RIPC对肾功能保护作用的具体机制尚未阐明。
线粒体自噬是通过自噬途径选择性降解过量或缺陷的线粒体，是线粒体质量控制的核心及细胞内维持稳态的必要条件[10]。不同途径介导的线粒体自噬作为肾脏的保护机制被激活，在应激条件下，线粒体自噬可以作为一种防御性或适应性机制被诱导，来维持健康的线粒体群体，以促进细胞存活[11]。线粒体自噬水平的不足和下降与AKI的发生、进展密切相关。
本研究结果显示：通过对IRI模型小鼠行RIPC后，小鼠Scr、BUN浓度明显下降，肾小管损伤半定量评分减低，说明RIPC可以减轻肾IRI。Beclin1、LC3A/B、p62均是参与线粒体自噬的关键分子。有研究[12]指出Beclin1是自噬启动的关键分子，Beclin-1/（VPS34）/VPS15/Atg14复合物可促使自噬囊泡成核；
LC3-I与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-II，介导吞噬泡的生长和闭合形成自噬体；
p62是自噬的选择性底物，在自噬过程中，它通过LC3相互作用区与LC3结合，依靠自噬溶酶体途径促使泛素化的线粒体在溶酶体内降解，同时其自身也被降解。因此p62蛋白含量的降低，以及Beclin1含量的增加和LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化可作为线粒体自噬激活的标志。此外，我们用TOMM20分别与LC3A/B及LAMP2进行免疫荧光双标共定位，标记线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体，描述线粒体自噬水平在早期和中期的变化，使线粒体自噬可视化。本研究通过对四组小鼠的线粒体自噬水平进行综合评估后发现，与I/R组相比，RIPC组LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白表达水平增高，p62蛋白光密度值降低，TOMM20与LC3A/B、TOMM20与LAMP2荧光共定位面积百分比增加，说明RIPC可以上调线粒体自噬水平。给予自噬抑制剂后，线粒体自噬水平降低且RIPC的肾保护作用被逆转，进一步支持RIPC可诱导线粒体自噬减轻肾IRI。
综上所述，RIPC可减轻小鼠急性肾IRI，其机制与激活线粒体自噬有关，为减轻AKI提供了新思路。
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