戴志英，杨梅桂，施逸岚，杨清华
（江苏省南通市疾病预防控制中心，江苏 南通 226000）
深海鱼金枪鱼、秋刀鱼、鲭鱼、沙丁鱼、鲐鱼、鲥鱼、马鲛鱼等肉质柔嫩鲜美，营养元素丰富，这些青皮红肉深海鱼中含有较多的组氨酸，如保存不当会发生质量变化，海鱼在微生物的组氨酸脱羧酶作用下产生大量组胺，当人体摄入过量的组胺时，会引起头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等反应，严重时还会危及生命[5,6]。现在市场上各类海鱼罐头很多，为确保市民食用安全，本文在GB5009.208-2016国家标准方法的基础上，建立了方便快捷的海鱼罐头中组胺的测定方法。
1.1 试剂与仪器
正戊醇（AR）、HCl（GR）、HClO4（GR）、Na2CO3（AR）、NaNO2（AR），国药集团化学试剂有限公司；
NaOH（GR上海山海工学团实验二厂）；
对硝基苯胺（AR阿拉丁试剂公司）；
组胺二盐酸盐标准品（GR德国）；
50g·L-1Na2CO3溶液5g Na2CO3用纯水溶解，并用纯水稀释至100mL，混匀；
250g·L-1NaOH溶液25g NaOH用纯水溶解并稀释至100mL，混匀；
1+11（v/v）HCl溶液55mL纯水中加5mL HCl，混匀；
甲液（对硝基苯胺溶液） 称取0.5g对硝基苯胺，加5mL HCl溶解后，再用纯水稀释至200mL，混匀，临用现配；
乙液（NaNO2溶液）称取0.5g NaNO2，用纯水溶解并稀释至100mL，混匀，临用现配；
偶氮试剂 吸取5mL甲液、40mL乙液混合，临用现配；
1000μg·mL-1磷酸组胺标准溶液 精密称取0.0250g组胺二盐酸盐标准品，溶于纯水，移入25mL容量瓶中，并用纯水稀释至刻度，混匀；
20μg·mL-1磷酸组胺标准使用液 吸取1mL 1000μg·mL-1磷酸组胺标准溶液于50mL容量瓶中，加纯水至刻度，混匀；
CFAPA-QC056B-1鱼肉粉中组胺残留量检测质控样品（指定值（452.8±64.9）mg·kg-1，大连中食国实检测技术有限公司）。
WFJ7200型分光度计（龙尼柯（上海）仪器有限公司）；
PRIMOR离心机（赛默飞世尔科技公司）；
TALB YS振荡器（Thoemner公司）；
50mL塑料离心管。
1.2 实验方法
1.2.1 标准曲线的制备 分别吸取20μg·mL-1的磷酸组胺标准溶液0.0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mL于10mL具塞比色管中，相当含0、4、8、12、16、20μg组胺，加水至1mL，加入1mL（1+11）HCl溶液，混匀，加入50g·L-1Na2CO3溶液3mL，偶氮试剂3mL，加水至刻度，混匀，放置10min，在480nm波长处，用1cm比色皿零管调零测定吸光度，绘制标准曲线。
1.2.2 样品处理 称取10g已绞碎均匀的样品于50mL塑料离心管中，加入5%的HClO4溶液40mL浸泡2～3h，将离心管置于电动振荡器中振荡10min，然后将离心管放到离心机以8000r·min-1的速度冷冻离心5min，取2～4mL上清液于50mL的塑料离心管中，用NaOH溶液调pH值为10～12，加入正戊醇9mL，将离心管置于电动振荡器中振荡5min，接着再以8000r·min-1的速度冷冻离心5min，取上层正戊醇提取液2mL于50mL塑料离心管中，加（1+11）HCl溶液9mL在电动振荡器上振荡5min，再以8000r·min-1速度冷冻离心5min，用一次性塑料吸管将上层正戊醇弃去，下层HCl提取液供测定。
1.2.3 样品测定 吸取HCl 2mL提取液于10mL具塞比色管中，以下操作同1.2.1标准系列同法操作，测定吸光度，计算样品中组胺含量。
1.2.4 计算公式
式中X：试样中组胺的含量，mg/100g；
m2：2mL HCl提取液的吸光度值相当含组胺质量，μg；
m1：取样量，g；
v1：HClO4溶液浸提试样的体积，mL；
v2：样品经HClO4溶液浸泡、振荡、离心后，从上层清液中吸取的体积；
9：第一个9是加入正戊醇的体积，mL、第二个9是加入（1+11）HCl溶液的体积，mL；
2：第一个2是吸取正戊醇提取液的体积，mL、第二个2是吸取（1+11）HCl提取液的体积，mL。
2.1 试样提取试剂的选择
GB5009.208-2016中用三氯乙酸提取液浸泡样品，但三氯乙酸极易潮解变成液态而影响使用，本文选用5%～10%的HClO4溶液代替三氯乙酸溶液浸泡鱼样[4]，在样品中加入组胺标准溶液做回收率试验，组胺添加浓度为3.6mg/100g，回收率结果见表1[2]。
表1 不同浓度提取液的回收率试验结果（n=6）Tab.1 Recovery test results of different concentrations of extract（n=6）
由表1可知，溶液HClO4含量分别为5%、8%和10%时，提取回收率均在90%以上，说明提取效果比较理想，考虑到HClO4是强酸，浓度高、腐蚀性强，故本文选用5%的HClO4溶液作为样品提取液。
2.2 HClO4提取液、偶氮显色反应酸碱度的控制
用正戊醇提取HClO4提取液中的组胺时，HClO4提取液必须用NaOH溶液调pH值至碱性在10～12之间[1]，以便于组胺能游离而被正戊醇提取。
组胺与偶氮试剂反应必须在弱碱性条件中进行，且反应时间必须控制在10min[1]，若酸碱度控制不当，过酸时部分组胺与酸反应，组胺减少，则与偶氮试剂反应后导致结果偏低；
过碱时，偶氮试剂的量会减少，也会导致结果偏低，只有在弱碱条件下，组胺与偶氮试剂方可完整反应，结果才会准确。
2.3 振荡方法和提取次数的选择
GB5009.208-2016中采用分液漏斗手动振摇方法来提取待测组份，手动振荡每次只能振荡两个样品，工作效率低，本文用50mL塑料离心管代替分液漏斗，手动振摇改为电动振摇，电动振荡一次可同时处理数十个样品，振荡充分，提取效率高。GB5009.208-2016中用正戊醇和（1+11）HCl溶液分别提取样液中待测组分时，每次3mL，共3次，这种提取方法步骤多，操作繁琐，本法用9mL正戊醇和9mL（1+11）HCl溶液各提取待测组份一次，该方法步骤少，节省检测时间[3]，本文用GB5009.208-2016法与本法同时对鱼罐头进行组胺测定，结果见表2。
表2 GB5009.208-2016法与本法检测样品中组胺结果（n=6）（mg/100g）Tab.2 Results of histamine by GB5009.208-2016 and this method（n=6）（mg/100g）
由表2可知，本法的提取效果优于GB5009.208-2016法，本法省时省力，可同时处理多个样品。
2.4 方法的线性范围及检出限
在本实验条件下，组胺含量在0～20μg/10mL范围内呈现良好的线性关系，相关系数γ=0.9999，线性方程Y=0.007275X+0.0211。测定11个样品空白溶液的吸光度，计算其标准偏差，方法的检出限为0.121μg·mL-1。
2.5 方法的精密度试验
用3种鱼罐头做精密度试验，相对标准偏差为2.74%～5.23%，结果见表3。
表3 样品精密度试验结果（n=6）Tab.3 Sample precision test results（n=6）
2.6 方法的准确度
采用标准物质法，分别称取2.5g鲐鱼标准物质6份，按1.2.2方法同法处理，按1.2.3方法测定吸光度，计算组胺含量，测得的组胺含量为44mg/100g，国家标准物质的参考值为（452.8±64.9）mg·kg-1，可见方法具有较好的准确性。
2.7 样品测定
称取各类海鱼罐头10g，按试验方法测定组胺含量，同时加入1000μg·mL-1磷酸组胺标准溶液0.36mL（含360μg组胺）进行加标回收试验，加标回收率为92.2%～96.7%，结果见表4。
表4 样品测定及回收率试验结果（n=6）Tab.4 Sample determination and recovery test results（n=6）
本文用5%的HClO4溶液代替国标方法中三氯乙酸溶液浸泡鱼样，手动振摇改为电动振荡将样品中的组胺浸提出来，正戊醇、（1+11）HCl溶液振荡提取待测组份各一次，该方法的精密度和准确度均符合检测要求，操作方便，工作效率高，可同时检测大批量样品中组胺含量。
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