王炫凯，赵彤，岳扬，王侯宇，曲宝成*，熊玉宇，张玉凤
(1.设施渔业教育部重点实验室(大连海洋大学)，辽宁 大连 116023；
2.大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁 大连 116630)
重金属是一种具有毒性、持久性、不可降解性和生物累积性的环境污染物，当人体接触重金属剂量超过安全阈值时，重金属会对健康产生重大风险。有研究表明，Pb、Cd、Hg可能影响神经系统、消化系统和男性生殖系统并扰乱骨骼造血功能，Cr6+对人类也有致癌毒性[1]，这些非必需重金属即使在低浓度下也可能是有毒的。必需重金属对生物体而言是必不可少的，但在高浓度时也可能具有毒性，如Zn、Cu的高摄入量可能对人体神经产生毒性[2]。长期以来，重金属的毒性安全广受关注。
鱼类等水产品因含有丰富的氨基酸、维生素和必需矿物质而深受消费者喜爱。为满足日益增长的人类消费需求，水产养殖产量快速增长，2020年中国水产养殖产量为5 224.20万t，已达捕捞产量(1 324.82万t)的3.94倍[3]。然而，高产量的水产养殖产品长期依赖于饲料、抗生素、杀虫剂和其他方面的投入[4],也造成了诸多不利影响，导致重金属等污染物在水产品中积累，进而通过食物链进行放大和转移，对人类健康产生威胁[5]。
目前，关于水产品重金属污染特征及健康风险的研究主要集中在浅海养殖、网箱养殖、池塘养殖等传统养殖领域。循环水养殖模式(recirculating aquaculture system，RAS)作为一种新兴的水产养殖方式，通过系统中各单元间的高效配合与管理，可大大提高水资源的利用率，也促进了对水体污染物的管理与营养物质的重复利用[6]。然而，由于其封闭管理的特征，随之而来的便是水交换率的降低，一旦污染物随源水进入该系统便较难再排出，最终将直接影响到水产品质量安全。目前，有关RAS养殖模式的研究，主要集中在养殖系统水处理工艺过程的改进提升、生物滤器载体填料的选择和系统病害的防治等方面，关于该系统养殖产品中重金属等污染物的研究鲜有报道。
红鳍东方鲀Takifugurubripes是中国北方重要的经济鱼类之一，其肌肉洁白如霜、滑腻似脂、滋味腴美、营养丰富，深受消费者的喜爱。然而，野生红鳍东方鲀无法满足消费者的需求，无毒、美味的红鳍东方鲀才是消费者的理想佳肴[7]，但目前尚不清楚循环水养殖红鳍东方鲀重金属等污染物的浓度水平及其对消费者是否存在健康风险。本研究中，以大连市某循环水养殖企业的主要水产品红鳍东方鲀作为研究对象，对不同养殖阶段红鳍东方鲀体内Pb、Cd、Hg、Cu、Cr 5种重金属的含量变化及重金属污染状况进行评价，并通过计算预计日摄入量、非致癌风险和致癌风险等健康风险评价指标，对循环水养殖红鳍东方鲀的重金属污染状况及健康风险进行研究与评价，以期为循环水养殖模式优化和科学管理提供参考。
1.1 材料
试验用鱼：2021年5月14日，在大连市某循环水养殖企业随机挑选不同养殖阶段，发育正常、体质健康的红鳍东方鲀14 尾，具体规格见表1。同时，取饲喂不同养殖阶段红鳍东方鲀所用的福星牌饲料若干。
表1 试验用不同养殖阶段红鳍东方鲀样本Tab.1 Sample of tiger puffer Takifugu rubripes at different stages
仪器：电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS 7500a，安捷伦科技有限公司)；
ETHOS大微波消解萃取系统和VB24 Plus赶酸器(均为北京莱伯泰科仪器股份有限公司)。
试剂：重金属标准溶液购于中国环境保护部标准样品研究所；
HNO3(体积分数65%，优级纯)购于天津市科密欧化学试剂有限公司；
H2O2(质量分数30%，优级纯)购于上海安谱实验科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 样品处理 将采集的样品放入洁净的聚乙烯塑料袋后转移至低温保温箱中，带回实验室冷藏保存。将鱼体用水清洗，再用高纯水淋洗后，待鱼体表面自然阴干后取样。稚鱼整体取样，幼鱼和成鱼解剖后取肝脏、皮肤、肌肉、性腺、鳃组织部位，均质后置入-20 ℃冰箱中保存待测。称取0.5 g样品置入微波消解罐，加入4 mL体积分数为65%的HNO3、1.5 mL质量分数为30%的H2O2，加盖静置过夜后放入微波消解仪中消解90 min(温度为180 ℃)，冷却后取出，缓慢打开罐盖将气体排出，转至赶酸仪赶酸60 min，赶酸温度为150 ℃，当溶液澄清近干且冒出白烟时将其从赶酸仪中取出并冷却至室温，用去离子水定容至50 mL。饲料样品处理参考鱼样做适当调整。
1.2.2 重金属测定
1)测定方法。样品消解后，采用ICP-MS仪测定样品中Pb、Cd、Hg、Cu、Cr 5种重金属的含量，测定方法参照《食品安全国家标准食品中多元素的测定》(GB 5009.268—2016)。按逐级稀释法配制成标准溶液，空白溶液为体积分数2%的稀硝酸。在测定过程中完成标准曲线的制作，并依据标准曲线计算得出样本中的重金属含量，结果均以湿质量计。
2)质量控制。利用重金属标准溶液进行质量控制，标准曲线相关性系数>0.99，重复建立标准曲线，两次响应斜率误差均<5%后开始对样品进行测试，每分析10个样品加1个标样测定，用于标准曲线校准，要求回收率为85%～120%。同时，每10个样品带2个空白试剂和1个基质加标，基质加标回收率为95.5%～110.0%。每个样品均设3个平行样，平行样浓度间的相对标准偏差<25%。每个样品重复测定3次，相对标准偏差<10%。
1.2.3 评价方法
1)污染状况评价。采用单因子污染指数法[8]和内梅罗综合污染指数法[9]进行鱼体重金属污染状况评价。计算公式分别为
Pi=Ci/Si。
(1)
其中：Pi为重金属i的污染指数；
Ci为重金属i的实测值(mg/kg)；
Si为重金属i的评价标准值(mg/kg)。当Pi<0.2时，为1级，无污染；
当0.2≤Pi<0.6时，为2级，轻度污染；
当0.6≤Pi<1.0时，为3级，中度污染；
当Pi≥1.0时，为4级，重度污染。
(2)
其中：Pin为重金属的内梅罗综合污染指数；
Pi,mean为各种重金属单因子污染指数的平均值；
Pi,max为各种重金属单因子污染指数的最大值。当Pin≤1时，为1级，无污染；
当1
2)人体健康风险评估。本研究中主要进行预计日摄入量评估[10]、非致癌风险评估和致癌风险评估[11]。评价指标计算公式为
EDI=(Ci×Im)/W×10-3。
(3)
其中：
EDI为重金属预计日摄入量[mg/(kg·d)]；
Ci为重金属i的实测值(mg/kg)；
Im为水产品的日均摄入率(g/d);W为平均体质量(kg);10-3为换算系数。Pb、Cd、Hg、Cu、Cr的允许日摄入量分别为1.50×10-3、8.00×10-4、4.00×10-2、5.00×10-1、4.30×10-3mg/kg[12]。
THQnon=(Fe×te×Im×Ci)/(Rf×W×ta)×10-3，
(4)
THQ=(Fe×te×Im×Ci×CSF)/(W×ta)×10-3。
(5)
其中：
THQnon为非致癌风险的目标危害商数；
Fe为暴露频率(365 d/a)；
te为暴露持续时间(70 a或6 a)；
Im为水产品的日均摄入率(g/d)；
Ci为重金属i的实测值(mg/kg)；
Rf为重金属口服参考剂量，Pb、Cd、Hg、Cu、Cr的口服参考剂量分别为4.0×10-3、1.0×10-3、1.0×10-4、4.0×10-2、1.5 mg/(kg·d)[12]；
W为平均体质量(kg)；
ta为非致癌物效应的平均暴露时间(te×365 d/a)；
10-3为换算系数。依据美国环保署相关标准，当THQnon<1时，表明儿童、成人均不存在非致癌风险；
当THQnon≥1时，表明儿童、成人均存在潜在的非致癌风险[13]。THQ为致癌风险的目标危害商数；
CSF为致癌斜率因子，其中Pb、Cd的致癌斜率因子分别为8.50×10-3、3.80×10-1mg/(kg·d)[14]。依据美国环保署相关标准，当THQ≤1×10-6时，表明儿童、成人均不存在致癌风险；
当 1×10-6
1.3 数据处理
试验数据均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 26软件对不同养殖阶段、样品类型的重金属含量进行双因素方差分析，用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。
2.1 不同养殖阶段红鳍东方鲀饲料中重金属平均含量
从表2可见,不同养殖阶段,红鳍东方鲀饲料中重金属平均含量依次为Cu>Pb>Cr>Cd>Hg，各种重金属含量均未超标，符合《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)中的规定。
表2 不同养殖阶段红鳍东方鲀饲料中重金属平均含量
2.2 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属平均含量及变化
从表3可见：在稚鱼、幼鱼和成鱼中，5种重金属平均含量依次为Cu>Cr>Hg>Cd>Pb；
在幼鱼和成鱼各组织中，Pb在皮肤中平均含量最高(分别为0.025、0.025 mg/kg)，Cd在肝脏中平均含量最高(分别为0.018、0.031 mg/kg)，Hg在肌肉、肝脏中平均含量最高(分别为0.028、 0.022 mg/kg)，Cu在肝脏中平均含量最高(分别为1.526、1.162 mg/kg)，Cr在肌肉中平均含量最高(分别为0.270、0.138 mg/kg)；
随着养殖过程的推进，鱼体中各种重金属含量呈先上升后下降趋势，在幼鱼出现峰值。在所检测的不同样品中，各种重金属含量均未超标，符合《食品安全国家标准食品中污染限量》(GB 2762—2017)、《无公害食品水产品中有毒有害物质限量》(NY 5073—2006)规定。
双因素方差分析表明：不同养殖阶段对Cd、Hg、Cu、Cr含量无显著性影响(P>0.05)，Pb因检出样本过少，无结果；
不同样品类型对Cd、Hg、Cu含量有显著性影响(P<0.05)，但对Cr含量无显著性影响(P>0.05), Pb因检出样本过少，无结果；
养殖阶段与样品类型的交互作用对Cd、Hg、Cu、Cr含量无显著性影响(P>0.05)，Pb因检出样本过少，无结果(表3)。在幼鱼和成鱼阶段，皮肤、肌肉、性腺、鳃中Cd的含量无显著性差异(P>0.05)，但均显著低于肝脏中Cd含量(P<0.05)；
肝脏、肌肉中Hg的含量无显著性差异(P>0.05)，但均显著高于其他组织(P<0.05)；
肝脏和性腺中Cu的含量显著高于其他组织(P<0.05)。此外，稚鱼、幼鱼、成鱼的全鱼中Cd、Hg、Cu、Cr的含量均无显著性差异(P>0.05)(表3)。
表3 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属平均含量Tab.3 Average contents of heavy metals in tiger puffer Takifugu rubripes at different breeding stages
2.3 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属单因子污染指数、内梅罗综合污染指数计算结果
单因子污染指数计算结果显示，3个养殖阶段相比，Cu、Hg在稚鱼阶段污染指数最高(分别为0.009、0.016)，Cd、Cr在幼鱼阶段污染指数最高(分别为0.074、0.090)，Pb在成鱼阶段污染指数最高(0.052)(图1(a))。内梅罗综合污染指数计算结果由高至低依次为幼鱼(0.07)>成鱼(0.05)>稚鱼(0.03)(图1(b))。
图1 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属的单因子污染指数、内梅罗综合污染指数Fig.1 Single factor pollution index and the Nemerow comprehensive pollution index of heavy metals in the body of tiger puffer Takifugu rubripes at different breeding stages
2.4 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属预计日摄入量、非致癌风险、致癌风险评价
2.4.1 预计日摄入量评价 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属预计日摄入量评价结果见表4。由于儿童、成人体质量差异，其预计日摄入量也呈现出不同结果，成人对不同养殖阶段鱼体内各种重金属的预计日摄入量均低于儿童。但不论成人还是儿童，对各种重金属的预计日摄入量均低于各自的允许日摄入量1～4个数量级。
表4 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属预计日摄入量(EDI)评价结果Tab.4 Estimated daily intake of heavy metals(EDI) by tiger puffer Takifugu rubripes at different stages of culture
2.4.2 非致癌风险评价 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属非致癌风险评价结果见表5。据此评价结果，不同养殖阶段鱼体内各种重金属对成人造成的非致癌健康风险均低于儿童，但各种重金属对成人、儿童的非致癌风险THQnon<1，表明均不存在非致癌风险。
表5 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属非致癌风险(THQnon)评价结果Tab.5 Non-carcinogenic risk assessment of heavy metals(THQnon) in tiger puffer Takifugu rubripes at different stages of culture
2.4.3 致癌风险评价 按照美国环保署综合风险信息系统的分类信息，本研究中仅对Pb和Cd进行致癌风险评价。不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属致癌风险评价结果见表6。将评估结果和美国环保署推荐标准比较后发现，不同养殖阶段鱼体内的Pb对成人、儿童的致癌风险THQ≤1×10-6，表明均不存在致癌风险；
成鱼体内的Cd对成人不会造成致癌风险，其他养殖阶段鱼体内的Cd对成人和儿童均表现出可接受的致癌风险，且对儿童造成的致癌风险要高于成人。
表6 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属致癌风险(THQ)评价结果Tab.6 Cancer risk assessment of heavy metal(THQ) in tiger puffer Takifugu rubripes at different stages of culture
3.1 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属富集规律
Cu作为一种必需金属，对促进鱼类新陈代谢具有重要作用[16]，因此，Cu较易被鱼类吸收，另外，Cu还是饲料添加剂的主要成分之一[17]。本研究显示，在稚鱼、幼鱼和成鱼中，5种重金属平均含量依次为Cu>Cr>Hg>Cd>Pb。鱼饲料中Cu的平均含量为(0.588±0.359)mg/kg，相对较高，这可能是造成鱼体内Cu含量较高的原因。鱼类不同器官对各种重金属的富集能力差异较大。杨妙峰等[18]研究发现，鲈Lateolabrax皮肤中Pb含量显著高于其他部位；
晏翰林等[19]研究发现,鲫Carassiusauratus肌肉中Hg含量相对较高；
曾欢等[20]等研究发现，鲇Silurusasotus肝脏中Cd、Cu含量高于鳃和肌肉；
马千里等[21]研究发现，大眼鳜SinipercakneriGarman肌肉中Cr含量相对较高(0.211 mg/kg)，本研究结果与之类似。本研究中幼鱼和成鱼肝脏中Cd与Cu含量、肌肉中Hg含量显著高于其他组织，皮肤中Pb含量、肌肉中Cr含量高于其他组织。Fernandes等[22]研究表明，鲻Lizasaliens肝脏、性腺具有代谢活性，有较强的重金属富集能力。徐承香等[23]对黄颡鱼Pelteobagrusfulvidraco、草鱼Ctenopharyngodonidella研究发现，部分重金属元素是通过体表渗透进入鱼体内，所以部分鱼皮肤中重金属含量高于其他组织。此外，本研究还发现，养殖初期鱼体内重金属的富集速率会随体长、体质量的迅速增加而增加，后期含量有所降低，可能与生理代谢过程有关，随着体长、体质量的不断增加，重金属在体内被稀释，浓度呈现下降趋势，闫海鱼等[24]对花鲢Aristichthysnobilis的研究也得到了类似的结果。鱼体器官中部分重金属含量随年龄的增长而不断增加，这与Farkas等[25]对Abramisbrama的研究结果大体一致，可能是由于鱼类等水生生物含有丰富的巯基蛋白质，降解周期较长，能够使Cu、Cd等重金属离子在鱼体内稳定存在，从而出现生物蓄积的现象[26]。
3.2 不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属污染评价
单因子污染指数、内梅罗综合污染指数分别用于对鱼体单一、复合重金属污染状况进行评价，是衡量鱼体重金属污染状况的重要指标。本研究表明，在养殖的3个阶段，红鳍东方鲀幼鱼体内重金属的内梅罗综合污染指数最高，陈海刚等[27]对近江牡蛎Ostrearivularis的研究中发现，在养殖初期，重金属浓度会随体质量的增加而增加，而后重金属浓度下降，可能与稀释效应有关。本研究中，综合单因子污染指数、内梅罗综合污染指数评价结果，不同养殖阶段红鳍东方鲀体内重金属含量均处于无污染范围。综上，该循环水养殖企业的红鳍东方鲀体内的重金属污染状况在安全范围内，但仍需对该系统进行监测管理与日常维护。此外，本研究中还发现，Cr在不同养殖阶段的单因子污染指数始终最高，对内梅罗综合污染指数贡献最大，虽处于安全范围，但仍需引起重视。
3.3 红鳍东方鲀体内重金属的健康风险
兴起于美国国家科学院和美国环保署的人体健康风险评价包括预计日摄入量评价、非致癌风险评价和致癌风险评价等内容，可预测重金属等污染物对人体健康的不利影响[28]。本研究中，根据预计日摄入量、非致癌风险、致癌风险评价结果，儿童对各种重金属表现出相对较高的健康风险，这意味着儿童对重金属的敏感程度要高于成人,更易受到重金属的威胁，因此，应予以高度重视。有研究表明，Pb、Cd等非必需金属会导致儿童生长畸形、发育障碍[29]。本研究中，综合健康风险评价结果，各种重金属对成人和儿童造成的健康风险均在可接受范围内，即适量食用该循环水养殖企业的红鳍东方鲀的健康风险较低，比较安全。
1)循环水养殖的红鳍东方鲀体内Cd、Cu、Hg在肝脏中的富集程度较高，Cr在肌肉中富集程度较高，但各种重金属含量均未超过GB 2762—2017、NY 5073—2006规定的安全标准。
2)Cd、Hg、Cu、Cr含量在红鳍东方鲀不同养殖阶段无显著性差异(P>0.05)，Cd、Hg、Cu含量在红鳍东方鲀不同组织部位有显著性差异(P<0.05)，肝脏、肌肉是重金属的主要富集器官。
3)鱼体重金属的单因子污染指数、内梅罗综合污染指数均处于无污染范围。根据健康风险评价结果，预计日摄入量对健康风险的贡献较小，儿童、成人的致癌风险均处于可接受范围，非致癌风险可忽略不计，但儿童的健康风险总体略高于成人。
综上，采用循环水养殖模式，红鳍东方鲀的重金属含量水平能够保持在安全范围之内，但仍需对该养殖体系进行长期监测管理。
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