魏延虎，任淑婷，张可妍，赵 琳*
（1. 延安大学医学院，陕西 延安 716000；
2. 延安市人民医院，陕西 延安 716000）
脊髓损伤是中枢神经系统的致残性损伤，严重影响患者的运动和感觉功能。脊髓损伤的病理生理过程分为原发性损伤和继发性损伤，脊髓继发性损伤后的病理生理过程复杂可逆，是目前集中研究的重点。自噬是维持细胞结构及功能稳态的生理过程，是机体重要的防御及保护机制。研究［1-2］表明自噬在脊髓损伤早期显著激活，作为继发性脊髓损伤的重要因素在其发生、发展过程中发挥作用。番茄红素是一类不饱和胡萝卜素，具有较强的抗氧化能力［3］，并可调节自噬［4］。近年，其在中枢神经系统的作用研究备受关注。本研究主要观察番茄红素对大鼠脊髓损伤后自噬的影响，探究番茄红素对大鼠脊髓损伤的保护作用机制。
1.1 动物与分组
健康清洁级雌性SD大鼠27只，体重210～220 g，6～8 周龄。随机分为假手术组、模型组及实验组各9 只，许可证号：SCXK（陕）2018-001。本研究经延安大学医学院实验动物伦理委员会批准（2020-018），实验操作严格遵守动物伦理保护法。
1.2 药物、试剂及仪器
番茄红素（生产批号：F-003-181224，厂家：成都瑞芬思生物科技有限公司）；
注射用戊巴比妥钠（批准文号：国药准字31020501，厂家：上海上药新亚药业有限公司）；
RIPA组织裂解液（北京索莱宝生物科技公司）；
Trizol 试剂（上海生工生物工程）；
反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；
BCA蛋白定量检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；
兔抗Beclin1、Atg5、GAPDH 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；
脊髓打击器（美国PSI 公司）；
冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；
PCR 仪（瑞士Roch公司）；
蛋白电泳和快速转印系统（美国BIO-RAD）。
1.3 方法
1.3.1 建立大鼠脊髓损伤模型 腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg 麻醉，以T10 棘突为中心在背部正中心作约2 cm 纵行切口，采用手术刀钳开紧靠棘突两边的背部肌肉，假手术组大鼠仅切除T10椎板，模型组及实验组大鼠在此基础上充分暴露脊髓，采用脊髓打击器打击脊髓，损伤力度200 kdyn/cm2。打击后大鼠尾部痉挛性摆动，躯体和双后肢出现不同程度扑动，随后完全松弛为建模成功。
1.3.2 给药方法 大鼠麻醉清醒后，实验组给予番茄红素玉米油溶液20 mg/kg 灌胃，假手术组和模型组给予等体积玉米油灌胃，1次/d，连续14 d。
1.3.3 运动功能评估 分别于术后1、3、7、14 d 后采用斜板试验评估脊髓损伤大鼠后肢运动功能，将大鼠置于垫有橡胶垫的长形窄斜板上，大鼠身体轴线和斜板纵轴垂直放置，从0°开始，每次抬高5°观察大鼠在斜板上能停留5 s 的最大角度，每只大鼠测量3次，取均值。
1.3.4 实时荧光定量PCR（quantitative real-time，qRT-PCR）检测自噬相关基因Beclin-1、Atg5 mRNA表达 术后7 d，3组大鼠各取3只脱臼处死，暴露取出损伤段脊髓组织，称取100 mg，提取总RNA，严格按照逆转录试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA，并作为模板建立反应体系。以β-actin为内参，引物序列如下：反应条件：95 ℃变性5 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，在PCR 仪 上 进 行40 个 循 环，通 过2－△△Ct法 计 算Beclin-1、Atg5 mRNA的相对表达量。
基因名称Beclin1 Atg5 β-actin正向引物（5"-3"）ATTCCTGCTTAGATGACGTA CAAAGCCATTGCAGACAT CTAAGCCTTAGCTGACTACTT反向引物（5"-3"）CGTTCATGGCTCGCTTCGTA CTAGGCAACTGAACACGT GGCATTTATAGCACCCGTCCTA
1.3.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测自噬相关蛋白Beclin1、Atg5 的表达 取3 组术后7 d 的脊髓样品各100 mg，加入RIPA 裂解液匀浆裂解，提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。上样并经SDS-PAGE湿转法分离目的蛋白并转移到PVDF 膜上，室温封闭2 h，加入Beclin1、Atg5、GAPDH 抗体4℃孵育过夜，TBST 洗涤3 次，加入二抗，室温孵育2 h，洗涤3 次后采用化学发光并拍照，采用Image J 软件计算蛋白灰度值。
1.4 统计学方法
2.1 3组大鼠斜板角度比较
术后1、3、7、14 d，3 组之间斜板角度总体比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。模型组和实验组斜板角度与假手术组比较明显减小（P＜0.05）；
术后7、14 d，与模型组比较，实验组斜板角度显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。表明番茄红素可以促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复。
2.2 3组大鼠脊髓组织Beclin1、Atg5 mRNA表达水平
术后7 d，Beclin1 在假手术组、模型组和实验组的相对表达量分别为1.03±0.05、1.28±0.08、1.40±0.13；
Atg5 在3 组的相对表达量分别为1.00±0.03、1.15±0.07、1.29±0.11，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。表明大鼠脊髓损伤后自噬相关基因Beclin1、Atg5 表达升高，而番茄红素可以促进其表达。
图1 Beclin1、Atg5相对表达水平
2.3 3组大鼠脊髓组织自噬相关蛋白Beclin1、Atg5表达水平术后7 d，Beclin1 蛋白在假手术组、模型组和实验组的相对表达量分别为0.53±0.06、0.86±0.05、1.11±0.09；
Atg5 蛋白在3 组的相对表达量分别为0.47±0.05、0.84±0.06、1.14±0.08；
组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，图2）。提示番茄红素可以激活自噬相关蛋白Beclin1、Atg5的表达。
表1 3组大鼠斜板角度比较（±s）
表1 3组大鼠斜板角度比较（±s）
注：a表示与假手术组比较P＜0.05，b表示与模型组比较P＜0.05。
组别假手术组模型组实验组FP 1 d 70.51±5.20 31.26±2.50a 31.51±2.43a 312.451＜0.05 3 d 71.58±5.40 32.69±2.61a 35.20±2.93a 243.712＜0.05 7 d 71.36±5.45 33.05±2.70a 42.09±3.51ab 195.172＜0.05 14 d 70.89±5.31 33.69±2.73a 47.60±3.91ab 166.463＜0.05
图2 A：各组大鼠自噬相关蛋白Western blot检测结果；
B：Beclin1蛋白相对表达水平；
C：Atg5蛋白相对表达水平
脊髓损伤后可导致严重的神经功能障碍甚至截瘫，而神经元凋亡是脊髓损伤后神经功能障碍的重要因素。神经损伤的相关研究表明，自噬与凋亡联系密切［5］。自噬是真核细胞内高度保守的生物学途径，在脊髓损伤早期可通过自噬清除细胞内受损的细胞器和变性蛋白质，维持细胞内环境的稳态。番茄红素是一种类胡萝卜素，在天然类胡萝卜素中抗氧化性能最强，是β-胡萝卜素的2倍，是维生素E的100 倍［6］。Hu 等［3］研究证实，番茄红素可通过增强抗氧化酶活性和清除氧自由基，提高机体的总抗氧化能力，对脊髓损伤发挥神经保护作用。而Zhang等［4］研究表明番茄红素也可以通过调节自噬，恢复海马功能障碍。黎妮等［7］研究发现番茄红素可显著提高高糖诱导的肾小球上皮细胞（足细胞）自噬水平。以上研究提示番茄红素具有重要的神经保护作用，除高效的抗氧化能力外，还可通过调节自噬发挥其生物学功能。而关于番茄红素对脊髓损伤后自噬的影响却鲜有研究报道。
Beclin1 和Atg5 是自噬相关通路的关键蛋白，Beclinl 可通过与PI3K形成PI3K复合体，调节Atg蛋白在自噬前体结构中定位，调节自噬活性。Beclin1是一个与Bcl-2 相连的自噬相关蛋白，参与自噬复合体的合成，促进自噬的激活，Beclin1 高表达提示自噬水平的增加［8］。Atg5是自噬过程的重要启动因子，用于衡量自噬程度的关键蛋白［9］，Atg5的增加对于自噬小体的形成具有基础性的作用。本研究qRT-PCR 和Western blot 结果发现，脊髓损伤后自噬通路相关因子Beclin1、Atg 5 在mRNA 表达和蛋白质水平均升高，说明脊髓损伤后自噬被激活，损伤区的细胞启动了自噬，神经细胞自噬水平的升高可能是脊髓组织对损伤的保护性反应；
给予番茄红素后Beclin1、Atg5进一步高表达，提示脊髓损伤后，番茄红素可通过提高Beclin1、Atg5的表达发挥对受损脊髓的保护作用。对比各组大鼠后肢运动功能的变化，发现给予番茄红素后，大鼠后肢运动功能明显优于模型组大鼠，表明番茄红素可促进大鼠后肢运动功能的恢复，并且番茄红素对大鼠脊髓损伤的保护作用可能是通过Beclin1-Atg5依赖性自噬通路来实现的。
综上所述，番茄红素可能通过上调Beclin1-Atg 5通路激活自噬发挥对脊髓损伤大鼠的神经保护作用，进一步深入探究番茄红素对脊髓损伤后自噬的影响及作用机制，将为临床靶向治疗脊髓损伤提供理论基础和实验依据。
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