姚欣妤 鲍泳扬 杨扬 胡恩萍 王珮华
头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤，每年全球新增确诊患者超过80 万人，新增死亡人数超过40 万，是第六大常见恶性肿瘤[1]。大多数被诊断的患者没有恶性前病变的表现，目前还没有任何筛查策略，临床医生的体格检查仍然是早期发现病变的主要方法[2]。头颈部鳞癌的原发灶诊断主要依赖肿块活检，病理诊断是该疾病诊断的金标准。基于组织形态学的病理诊断主要依靠病理医生的经验，术中切除范围由手术医生决定，如切缘肿瘤阳性会造成手术时间的延长。除此之外，在癌症的治疗中，准确的诊断和彻底的原发灶切除可以降低癌症死亡率，延长患者生存时间。因此，探索一种客观准确且快速的术中诊断方法或是更精准的筛查手段是研究者值得努力的方向，本次实验对其进行探索。
拉曼光谱基于光子与目标材料的相互作用，运用非弹性散射探测与样品中化学键相关的分子振动，以获得有关分子结构、组成和分子间相互作用的信息，产生样品的高度详细的生化“指纹”，具有高度特异性[3]。随着相关技术及光学仪器的发展，拉曼光谱在医学领域中的研究也取得了较大进展。许多实验研究已经证明了拉曼光谱在评估卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和皮肤癌等方面的能力[4-8]。本文对6 例口鼻部鳞癌患者的肿瘤细胞与癌旁组织细胞的拉曼光谱信息进行采集和比对，通过比较光谱的差异探索拉曼光谱在口鼻部鳞癌诊断过程中的价值。
1 临床样本
6 例就诊于上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔科及耳鼻喉科的口鼻部鳞癌患者，收集手术中新鲜切除的肿瘤组织，包括鼻背部1 例，上唇4例，舌1 例，涉及各种分化程度，低、中、高分化各2例。使用冷冻切片机（型号：LEICA CM 1950）将每个组织样品进行连续的切片，切片厚度4μm，筛选包含肿瘤及癌旁组织的连续切片，每例样本各选取两张。其中一张切片用于苏木精-伊红染色（HE 染色）及细胞定位，即常规病理诊断的HE 切片，另一张切片不做染色直接用于拉曼光谱测量。由于石蜡切片在制作过程中会出现脂质丢失的现象，为保留切片上的物质信息，拉曼测量时采取未经石蜡包埋的冷冻切片。本实验样本为常规病理诊断中产生的剩余废弃切片，样本已去标识化使不具个体识别性且无法溯源，征得豁免“受试者的知情同意”，本研究经上海交通大学医学院附属第九人民医院医学伦理委员会批准（SH9H-2020-T74-1）。
2 测量仪器
本研究使用基于正置显微镜的XploRA PLUS共焦显微拉曼系统（HORIBA Scientific, Japan）进行拉曼光谱的检测。光谱分辨率为1cm-1，激发光源为532nm 半导体激光器，激光光斑直径约为1μm。
3 测量方法
切片的连续性使未染色的冷冻切片与HE 染色片图像上可对应，依据癌巢形态的图像特征（如癌巢轮廓及细胞分布形态等）使得HE 切片的图像可用于癌巢及癌旁组织定位从而在显微镜下选择冷冻切片的分析区域。然后，在冷冻切片上对应区域内的5 个或以上随机位置，获取癌及癌旁组织的拉曼光谱（图1）。选择拉曼光谱测量参数，激发功率大约为12.4mW，光谱的测量范围为300~3500cm-1，数据采集积分时间10s，连续采集3 次，迭代降噪处理后获得拉曼光谱。
图1 HE 及冷冻组织切片的明场照片A：HE 染色的切片，经NDP.view 2.6.13（Hamamatsu Photonics, Japan）组织切片软件采集；
B：无染色的相邻切片，经共焦显微拉曼系统上的LabSpace6.0（HORIBA Scientific, Japan）软件采集。
4 数据处理
使用LabSpace 6.0（HORIBA Scientific, Japan）进行包含光谱数据的平滑、基线校正、归一化等预处理，以获得切片上较真实的拉曼信号。使用Origin 2018b 软件（OriginLab, USA）进行拉曼光谱的均值计算和主成分分析等统计学分析。
在6 例口鼻部鳞状细胞癌的组织切片上采集到34 条癌组织和36 条癌旁组织的拉曼光谱（图2）。我们对这两组光谱进行了统计学分析。
图2 切片的拉曼平均谱A：口鼻部鳞状细胞癌组织；
B：口鼻部鳞状细胞癌旁组织。阴影部分的上缘和下缘分别为拉曼位移波数（raman shift）对应的拉曼信号最大值和最小值。
两组织拉曼光谱的平均峰在形态上较近似，我们运用主成分分析法（PCA）对两组光谱进行了分析。利用前两个主要成份，即主成分1（PC1）和主成分2（PC2），作二维散点图（图3）。结果表明，主成分PC1（89.7%）可以有效地区分口鼻部鳞状细胞癌和癌旁组织的拉曼光谱。
图3 口鼻部鳞状细胞癌及癌旁组织拉曼光谱经PCA分析后的散点图红色标记癌旁组织，黑色标记癌组织，椭圆为95%置信区间
我们从PC1 中提取了5 个特征峰，它们累计贡献了98.11%的差异特征（表1）。根据之前的研究[9，10]，我们进行了谱峰归属的标注。
表1 特征峰的拉曼光谱归属
特征峰的拉曼光谱归属表明，口鼻部鳞状细胞癌及癌旁组织的核酸，蛋白质及脂类物质均有差异。以差异的贡献程度看，脂类的差异比较明显。
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）起源于口腔、咽、喉和鼻窦等部位的上皮，侵袭性强，复发转移率高，临床预后预测较差。在细胞组织学上，上皮在经过一系列有序的步骤后逐渐进展为侵袭性头颈部鳞状细胞癌，从上皮细胞增生开始，接着是不典型增生（轻度、中度和重度）、原位癌、最终是侵袭性癌。尽管有证据表明从细胞异型性到不同程度的异常增生，最终导致侵袭性头颈部鳞状细胞癌有一定的过程，但大多数患者就诊时已经为浸润性癌，没有明显的恶性前体征。因此本次实验我们对发生在口鼻部黏膜的鳞癌样本进行癌巢及癌旁肿瘤未侵及的组织进行了拉曼光谱测量，通过光谱学改变的分析发现它们之间的差异。
拉曼效应最早由拉曼教授发现，因此于1930年获得诺贝尔奖[3]。它是一种无损、无试剂的振动光谱技术，提供了体内或体外组织的快速分子表征检测，可用于活检、切缘判断、治疗评估或实验需要。根据每个样品具有的核酸、蛋白质、脂质等物质携带的活性官能团的特征性光谱，对样本组织类型进行评估、表征和区分。拉曼光谱可以从肿瘤组织的分子基础出发，为诊断和治疗过程提供客观、可量化的光谱信息，以达到早期、快速和准确的诊断使患者受益匪浅。
以细胞株为实验对象的拉曼光谱研究表明，相对正常人体口腔黏膜细胞而言，人舌鳞癌细胞的拉曼光谱存在差异，提示该类细胞有比较明显的增殖活性[11，12]。我们本次研究采用临床样本进行研究，以自身未受肿瘤影响的癌旁组织为对照，经过主成分分析及谱峰归属的标注，发现口鼻部鳞状细胞癌及癌旁组织的脂、蛋白及核酸在光谱信息上均有差异，包括2927cm-1的（脂）芳香族内C-H 伸展、2877cm-1的（脂）-CH3对称伸缩、1654cm-1的（蛋白）I 型酰胺基团、1450cm-1（蛋白）生物分子中的亚甲基形变、1319cm-1（核酸）鸟嘌呤。此次实验取样方式及样本制备方法与病理科诊断时样本制备方法一致，依据常规耳鼻喉及口腔科手术术式，均按照临床诊疗指南进行，为进一步的临床运用研究提供思路。拉曼光谱以组织切片的形式使光斑可对应到单个细胞，精确度更高，产生与细胞一一对应的光谱对于后期术区切缘的把握更有意义，且病理切片是目前的诊断金标准，但其结果判读具有个人经验性，会产生误差，光谱可将组织中的信息以化学键产生的光谱如实记录下来，实现细胞指纹图谱的价值。随着研究的进一步深入，这些光谱差异所提示的癌组织物质变化，可能会为口鼻部鳞状细胞癌的发生发展的机制研究提供线索。
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