郑光明，孙建华，宋秋月
（恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北恩施 445000）
随着近年来人类生活方式、饮食习惯的改变，各类恶性肿瘤疾病患病人数明显增加且呈逐年增长趋势，结直肠癌就是其中最具代表性的一种[1]。流行病学调查显示，结直肠癌的发病率和死亡率在全国范围内均较高，在我国的发病率居第三位，患者五年生存率为32%左右，该疾病的具体起病机制目前尚在研究中，分析原因可能与遗传、环境、饮食及老龄化社会进程加快有关[2]。锌指蛋白（zinc finger protein ，ZNF）近年来被认为参与各种肿瘤的发生与发展，且多项研究证实ZNF 能通过调控相关基因转录和表达介导肿瘤的发生和转移[3]。ZNF 139 作为锌指蛋白家族中的一员，近年来据相关研究显示其在膀胱癌、骨肉瘤的发生和转移中扮演重要角色，但查阅相关资料发现，关于ZNF139 在结直肠癌中作用的研究较少[4]。基于此，本文选取收治的67 例结直肠癌患者开展研究，术中取所有患者肿瘤病灶及正常癌旁组织，测定ZNF139 在不同组织中的表达情况，分析ZNF139 与结直肠癌患者临床病理的关系，以供后续研究参考。
1.1 研究对象 选取2012年5月～2014年6月于恩施土家族苗族自治州中心医院收治的67 例行手术治疗的结直肠癌患者临床资料进行研究，其中男性36 例，年龄55 ～83(68.60±7.50)岁，体质量指数21.30±1.20 kg/m2；
女性31 例，年龄55 ～82(69.05±7.16)岁，体质量指数21.05±1.44 kg/m2；
肿瘤直径：＜5 cm 47 例，≥5 cm 20 例；
分化程度：低/未分化42 例，中/高度分化25 例；
浸润程度：T1/T2 38 例，T3/T4 29 例；
TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期33 例，Ⅲ～Ⅳ期34 例；
发生淋巴结转移30 例，无淋巴结转移37 例。本研究获得我院医学伦理委员会批准，患者及家属均知情并签署知情同意书。
1.2 仪器和试剂 SP 免疫组织化学染色试剂盒及相关配套试剂（北京中杉金桥生物有限公司），VERITI 型PCR 仪（美国ABI 公司），Leica 光学显微镜（德国Leica 公司），枸橼酸钠抗原修复液（上海基因公司），DAB 显色试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司）等。
1.3 方法
1.3.1 样本采集：所有患者均行手术治疗，术中切除肿瘤病灶，取新鲜结直肠癌组织、距肿瘤病灶边缘3cm 处癌旁组织、远离癌肿病灶区域的正常结直肠黏膜组织，大小1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm，每项样本各取两份，一份采集后即刻使用10g/dl 中性甲醛固定，以备后续免疫组织化学染色；
另一份低温下保存，供RNA 提取使用。
1.3.2 SP 免疫组织化学染色检测结直肠癌组织中ZNF139 蛋白表达：结直肠癌组织标本经10g/dl 甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片4 μm，脱蜡，梯度乙醇脱水，加入3g/dl H2O2室温孵育清除内源性过氧化物酶活性，置入枸橼酸钠修复液进行抗原修复至冷却，后以正常山羊血清工作液封闭，滴加一抗4℃孵育过夜（PBS 缓冲液代替一抗做阴性对照），再滴加二抗孵育，后加入辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液孵育；
DAB 溶液显色，蒸馏水冲洗终止反应，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片；
显微镜下观察目标蛋白表达情况。
结果判读：镜下进行细胞计数，显示细胞胞浆、膜内出现棕黄色颗粒或细胞核呈棕黄色即为阳性显色，随机观察5 个视野，采用二次计分法：①染色强度：棕褐色（3 分），棕黄色（2 分），淡黄色（1 分），无色（0 分）；
②阳性细胞率：阳性细胞率＞75%（4分），51%～75%（3 分），10%～50%（2 分），＜10%（1 分）。计算两者乘积，0 分为阴性记为“-”，1 ～3分为弱阳性记为“+”，4～8分为中等阳性记为“++”，9 ～12 分为强阳性记为“+++”。
1.3.3 RT-PCR 法检测结直肠癌组织中ZNF139 mRNA 表达：采用Trizol 法经吹打、裂解、离心等提取细胞总RNA，测定A260nm/A280nm值及RNA 浓度；
于无RNA 酶的PCR 反应管加入反应体系及试剂进行变性反应处理，后加入逆转录酶并按照说明书进行孵育反转录为cDNA，置于-20℃低温中保存备用；
采用RT-PCR 试剂盒，经变性、退火、延伸、循环反应条件进行PCR 扩增，后行产物实时定量PCR 分析，检测反应产物的特异性及基因表达情况；
并以GAPDH 为参照，计算目标基因在各组织中的mRNA 相对表达量。
1.3.4 随访：术后通过电话及门诊复查等方式对入组结直肠癌患者进行为期5年的随访，随访截止时间为2019年6月，以患者死亡或随访结束为终止时间。
1.4 统计学分析 使用统计学软件SPSS19.0 处理数据，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间行独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析；
计数资料采用n（%）表示，ZNF139 表达与临床病理间的相关性采用χ2检验；
采用K-M 生存曲线绘制ZNF139 阳性及阴性患者预后5年总生存率，采用Log-rank 法检验；
COX 回归模型进行预后生存单、多因素分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 ZNF139 mRNA 及蛋白在结直肠癌组织中的表达 免疫组织化学染色显示，ZNF139 蛋白主要定位于细胞核和细胞质中，呈黄至棕褐色颗粒；
结直肠癌组织中ZNF139 蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织及正常组织[35（52.24%）vs 19（28.36%），13（19.40%）]，差异均有统计学意义（χ2=7.941，15.711，均P＜0.001）。癌旁组织与正常组织中ZNF 13P 蛋白阳性表达率差异无统计学意义（χ2=1.478，P=0.224）。
RT-PCR 检测结果显示，结直肠癌组织中ZNF139 mRNA 水平明显高于癌旁组织及正常组织（0.651± 0.130 vs 0.217±0.070，0.201±0.052），差异有统计学意义（t=24.060，24.947，均P＜0.001）。癌旁组织和正常组织中ZNF139miRNA 表达水平差异无统计学意义（t=1.502,P=0.136）。
2.2 ZNF139 mRNA 及蛋白与结直肠癌临床病理参数的关系 见表1。结果发现，年龄、性别和肿瘤直径对结直肠癌组织中ZNF139 mRNA 表达无影响（均P＞0.05）；
肿瘤病灶浸润程度、TNM分期与ZNF139 mRNA 表达呈正相关，即浸润程度和TNM 分期越高的结直肠癌组织中ZNF139 mRNA 表达水平越高（均P＜0.05）；
肿瘤分化程度与ZNF139 mRNA 表达呈负相关，低/未分化组织中ZNF139 mRNA 表达水平明显高于中/高度分化组织（P＜0.05）；
伴有淋巴结转移的病灶组织中ZNF139 mRNA 表达水平明显高于无淋巴结转移组织（P＜0.05）。ZNF139 蛋白与结直肠癌临床病理参数关系分析，年龄、性别和肿瘤直径对结直肠癌组织中ZNF139 蛋白阳性表达均无明显相关（均P＞0.05），肿瘤病灶浸润程度、TNM 分期与ZNF139 蛋白阳性表达呈正相关，即浸润程度和TNM 分期越高的结直肠癌组织中ZNF139 蛋白阳性表达率越高（P＜0.05）；
肿瘤分化程度与ZNF139 蛋白阳性表达呈负相关，低/未分化组织中ZNF139 蛋白阳性表达率明显高于中/高度分化组织（P＜0.05）；
伴有淋巴结转移的病灶组织中ZNF139 蛋白阳性表达率明显高于无淋巴结转移组织（P＜0.05）。
表1 ZNF139 mRNA 和蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的关系
2.3 ZNF139表达与结直肠癌预后的关系 见图1。对67 例结直肠癌患者进行随访，均获得完整随访资料，时间截止到患者死亡或2019年6月。根据ZNF139 表达情况，将入组患者分为ZNF139 阳性组（n=35）和ZNF139 阴性组（n=32），采用Kaplan-Meier 生存曲线分析ZNF139 表达与结直肠癌患者预后生存的关系，结果显示ZNF139 阳性组患者5年总生存率为51.43%（18/35），ZNF139 阴性组患者5年总生存率为75.0%（24/32），Log-rank 检验ZNF139 阴性组患者总体生存率大于阳性组患者，差异有统计学意义（χ2=3.391，P=0.047）。
图1 ZNF139 阳性和阴性结直肠癌患者预后5年生存率
2.4 结直肠癌患者预后相关因子COX 回归分析见表2, 表3。COX 回归单因素分析显示，ZNF139表达、临床TNM 分期、淋巴结转移、分化程度及浸润程度与结直肠癌患者总体预后显著相关（均P＜0.05），是影响其总体预后的危险因素。后将单因素分析中差异有统计学意义的变量进行COX 多因素分析，结果显示ZNF139 表达（HR：2.249，95%CI：1.359 ～3.712，P=0.003）、临床TNM 分期（HR：2.016，95%CI：1.230～3.327，P=0.006）、淋巴结转移（HR：2.125，95%CI：1.302～3.469，P=0.002）是影响结直肠癌患者总体预后的独立因素。
表2 结直肠癌患者总体预后COX 单因素回归分析
表3 结直肠癌患者总体预后COX 多因素回归分析
结直肠癌主要起源于结肠或直肠上皮黏膜组织，是一种临床常见的恶性肿瘤疾病，在全球范围内具有较高的发病率[6]。结直肠癌患者早期无特征性症状表现，便血症状与痔疮类似，难以鉴别，诊断检出率较低，容易延误最佳治疗时机，当出现典型症状时病情往往已进展至中后期，治疗难度加大，患者预后欠佳，五年生存率较低。研究发现肿瘤的发生发展受细胞侵袭、迁移、细胞外基质降解及肿瘤血管形成等病理改变的调控[7]。因此，提高结直肠癌早期诊断检出率是临床研究的重点，进一步探究结直肠癌发生发展的分子机制，找寻更加灵敏的生物标志物及新的治疗靶点，对提高结直肠癌早期诊断效率具有积极意义。
近年锌指蛋白家族在结直肠癌分子调控过程中崭露头角，锌指蛋白因结构形似“手指”命名，其由多个半胱氨酸或组氨酸组成，能够结合Zn2+，可通过自主折叠形成稳定的四面体结构[8]。大量研究表明[9]，锌指蛋白特殊的指状结构能够识别结合DNA，RNA 序列，干预基因的转录表达，其作为重要的人体转录因子参与分化、增殖、代谢、信号转导等生物学过程，且发现人类基因组中约有1%序列编码是含有锌指的蛋白质。并证实锌指蛋白在包括结直肠癌在内的多种肿瘤的发生发展中扮演重要角色，是肿瘤诊断及预后预测的重要标志[10]。锌指蛋白139（ZNF139）是Krüppel 家族成员，其基因位于染色体7q21.3-q22.1，是一种转录相关蛋白[11]。实验表明[12]，Krüppel 家族锌指蛋白能够调控细胞多种生理过程及相关基因的表达和转录，介导肿瘤的发生发展及肿瘤耐药。发现人先天性裂手/足畸形及血液系统恶性肿瘤基因重排与ZNF139 基因缺失密切相关，因此将ZNF139 基因列为评估疾病发展、恶化的参考指标之一[13]。近年在肿瘤发生、发展中的研究表明，ZNF139 参与调控靶基因区域或靶蛋白的活性[10]。据报道，肺癌患者病灶组织中ZNF139 水平高表达，且随着肺癌治疗化疗药物用量增加，ZNF139 表达水平逐渐升高，提示ZNF139基因与肺癌的发生、发展及化疗耐药情况密切相关[14]。骨肉瘤组织中ZNF139 表达明显高于正常组织，猜测ZNF139 可能参与骨肉瘤的发生和发展[15]。胃癌组织中ZNF139 高表达与淋巴结转移关系密切，提示ZNF139 基因可能参与胃癌的发生及转移过程[16]。此外还发现，ZNF139 通过上调多药耐药相关蛋白1（MRP1）的表达可介导胃癌耐药的发生，沉默ZNF139 能够抑制肿瘤细胞的生物学功能[17]。ZNF139 通过激活PI3K/AKT 通路促进了膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭[4]。提示ZNF139 与肿瘤发生发展关系密切，故进一步研究其在肿瘤中的表达作用有助于探寻新的结直肠癌治疗靶点。本研究基于临床病理及预后探究发现，结直肠癌病灶组织中ZNF139 mRNA 及蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织和正常组织；
ZNF139 表达与临床分期、浸润程度、分化程度及淋巴结转移密切相关，提示ZNF139 高（阳性）表达患者浸润程度越深，临床分期越高，分化越低，更易发生淋巴结转移，说明ZNF139 基因与结直肠癌的发生、发展和恶性程度密切相关；
通过分析预后显示ZNF139 阴性表达患者具有良好的5年总生存率，ZNF139 表达是影响预后的独立危险因素之一，提示ZNF139 基因可能以某种机制参与调控结直肠癌的发生发展，可作为结直肠癌临床诊断及评估预后的参考指标。故可将ZNF139 基因表达参与调控结直肠癌恶性进展的作用及其相关分子机制作为后期研究的方向。
综上所述，ZNF139 在结直肠癌组织中高（阳性）表达与结直肠癌的分化、浸润、TNM 分期和有无淋巴结转移密切相关，可能参与结直肠癌的发生与演变；
同时ZNF139 表达是影响其患者预后的独立危险因素，可作为临床诊断及评估预后的参考指标，值得在临床中进一步研究。