倪雅娟，白鸿远，朱文静，刘 畅，王小芳
（西安交通大学第二附属医院心内科，陕西西安 710004）
心肌细胞凋亡是心力衰竭发生的重要病理机制之一[1]。线粒体介导的细胞凋亡是凋亡的重要途径，而线粒体生物合成受到抑制可诱导细胞凋亡[2-4]。线粒体生物合成是一个严格调控的生物过程[5]，过氧化物酶体增殖物活化受体γ共活化剂-1（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1,PGC-1）是调控该过程的重要因子[6]，PGC-1 的表达变化与线粒体生物合成功能直接相关。核呼吸因子（nuclear respiratory factor, NRFs）作为 PGC-1 下游转录因子靶标，是连接核编码基因和线粒体生物合成主要的转录调节因子；
线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor, TFAM）是 mtDNA 转录和复制所必需的，通过序列特异性方式与线粒体启动子序列（包括重链和轻链特异性启动子）结合，从而有效激活mtDNA 转录[7-8]。本课题组前期研究发现，传统中药肉苁蓉提取物松果菊苷（echinacoside, ECH）可抑制大鼠心肌重构，改善心功能[9]，然而具体机制并不十分清楚。本研究观察ECH 通过PGC-1/NFR 信号通路对线粒体生物合成和心肌细胞凋亡的影响，以阐明ECH 的作用机制，并为进一步研发防治心力衰竭新药物提供理论依据。
1.1 实验动物及仪器与试剂
SPF 级雄性SD 大鼠，遗传基本组成为远交群大鼠，系杂合的雄性大鼠和Wistar 雌性大鼠杂交后育成的一个白化封闭群大鼠，5 周龄，体质量140～160 g，购于西安交通大学医学部实验动物中心，生产许可证号：SCXK(陕)2012-003。
THONOS 2500心脏彩色超声诊断仪(美国惠普公司)，透射电镜（H-7650，日本日立公司），超微量分光光度计（美国NanoDrop 公司），PCR 扩增仪、Real-time PCR 仪（美国Bio-Rad公司），Fermentas反转录试剂盒（美国 Fermentas 公司），SYBR®PrimeScriptTMRTPCR Kit（日本TaKaRa公司），ECH（美国MCE 公司），Bax、Bcl-2、β-actin 兔抗大鼠多克隆抗体（美国 Santa Cruz 公司)、羊抗兔IgG.FITC(武汉博士德生物工程有限公司)，微型凝胶电泳系统、Chemi-Doc XRS 化学发光荧光成像仪(美国 Bio-Rad 公司)，ECL 发光液(美国Pierce 公司)，BCA 蛋白定量试剂盒、单去污裂解液(美国 Biotech 公司)，蛋白酶抑制剂混合物(cocktail，美国 Roche 公司)。
1.2 ISO 诱导大鼠心力衰竭模型的建立及评价
SD大鼠随机分为Ctrl组、HF组和ECH组，均为n=7。Ctrl组无干预；
HF 组采用腹腔注射 10 mg/（kg·d）异丙肾上腺素（ISO），持续2周；
ECH组在注射ISO前30 min予ECH 20 mg/（kg·d）腹腔注射预处理。给药干预持续2周后，行心脏超声检查，评价各组大鼠心功能。
1.3 Western blotting 检测心肌细胞凋亡相关蛋白的表达
左心室心肌组织取材、匀浆，提取总蛋白，具体参照文献方法[10]。BCA 法测定蛋白浓度后，95 ℃煮沸5 min 变性，上样、电泳，100 V 恒压转膜 90 min 转膜，在50 g/L 脱脂奶粉的TBST 中4 ℃过夜封闭，孵育一抗（Bax、Bcl-2，1∶200），洗涤后滴加二抗（羊抗兔IgG HRP 抗体）孵育，ECL 试剂盒显色，ChemiDoc XRS 化学发光荧光成像仪采集图像，Quality One 软件分析结果，以目的蛋白条带累计吸光度值／内参β-actin 累计吸光度值评价蛋白相对表达。
1.4 透射电镜观察心肌线粒体数量及质量
100 mL/L 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠并取出心脏，左心室心肌组织取材，4 ℃固定于25 mL/L 戊二醛中，剪碎为约1 mm3的立方体，再固定2 h 后洗涤，10 g/L 锇酸固定，丙酮脱水，包埋，37 ℃烘箱过夜，制作 0.8 μm 超薄切片，透射电镜下（30 000 倍）计数线粒体个数及空泡化变性的线粒体（空泡化线粒体有双层膜结构，有残存的嵴结构，形状不异常大）。线粒体空泡化率=（空泡化线粒体个数／所观察到的线粒体总数)×100%，线粒体密度=(正常形态的线粒体个数/100 μm2视野)。每张切片共计数10 个不同视野，每组观察3 张切片。
1.5 检测线粒体生物合成相关基因PGC-1、NFR-1、NFR-2、TFAM 的 mRNA 表达
左心室心肌组织取材同1.3 项，匀浆后Trizol法提取总RNA，紫外分光光度法测定RNA 的纯度及浓度，按照Fermentas 公司的反转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA 后，构建Real-time PCR 反应体系，加入引物（表 1）并扩增，94 ℃ 3 min 预变性，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s（循环 45 次）；
72 ℃ 10 min，Realtime PCR IQ5TM 采集扩增信号，获得循环阈值（CT值），以 2-ΔΔCT法分析结果。
表1 RT-PCR 的基因引物序列Tab.1 Primer sequence of genes
1.6 统计学分析
统计分析使用SPSS 15.0 软件，计量数据以均数±标准差()表示，数据进行正态性检验，符合正态分布，方差齐性，3 组间比较用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 超声心动图观察心功能情况
超声心动图观察结果显示，HF 组大鼠LVEDs、LVEDd 较对照组增加, LVEF 与LVFS 较对照组明显降低，提示HF 组大鼠心功能明显降低；
而ECH 干预组 LVEF 及 LVFS 明显提高，LVEDs 及 LVEDd 降低(均P＜0.01，表 2)。这提示 ECH 可明显改善 HF 大鼠心功能。
表2 各组大鼠超声心动图观察指标的比较Tab.2 Comparison of echocardiographieal results among the three groups(n=7)
2.2 ECH 对HF 大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响
Western bloting 检测结果表明，HF 组大鼠心肌组织促凋亡蛋白Bax 表达明显升高，而ECH 组Bax表达明显下调，HF 组抗凋亡蛋白Bcl-2 表达明显下调，而ECH 组Bcl-2 表达上调，证实ECH 明显下调Bax，且上调 Bcl-2（均P＜0.01，图 1）。提示 ECH 可能抑制HF 大鼠心肌细胞凋亡。
图1 ECH 抑制Bax 蛋白表达并上调Bcl-2 蛋白表达Fig.1 ECH inhibited the expression of bax and up-regulated the expression of Bcl-2
2.3 透射电镜观察结果
透射电镜下可见，HF 组形态、结构异常（大小不均一、结构模糊）的线粒体密度较Ctrl 组明显增加，出现大量线粒体肿胀、嵴模糊、崩塌或凝集、坏死、空泡化等改变，而形态规整线粒体密度明显减少；
ECH 组形态正常的线粒体较HF 组明显增加，变性的线粒体明显减少。统计学分析结果示，三组间线粒体密度及线粒体空泡化率差异有统计学意义，HF 组形态规整的线粒体密度较Ctrl 组明显减少，而线粒体变性率较Ctrl 组明显增加；
ECH 组线粒体变性较HF 组明显减轻，正常形态的线粒体密度明显增加，线粒体变性率减少（P＜0.05，图2）。结果提示，ECH 可能促进线粒体生物合成，抑制线粒体变性。
图2 透射电镜观察各组心肌细胞线粒体变化及统计学分析结果Fig.2 The changes of mitochondria in myocardium were observerd with transmission electron microscopy in the three groups and statistical histogram
2.4 各组心肌组织 PGC-1、NFR-1、NFR-2、TFAM的mRNA 表达情况
Real-time PCR 结果显示，HF 组心肌组织中PGC-1、NFR-1、NFR-2、TFAM 的 mRNA 较 Ctrl 组明显下调，ECH 干预可明显上调各基因mRNA 表达（P＜0.05，图 3）。这提示 ECH 通过上调 PGC-1/NFRs 信号通路而促进线粒体生物合成。
图3 Real-time PCR 检测各组心肌组织中线粒体生物合成相关基因的mRNA 表达情况Fig. 3 The mRNA expressions of genes promoting mitochondrial biosynthesis in myocardium were detected by Real-time PCR
心肌细胞凋亡导致心肌细胞丢失是心力衰竭的重要病理机制之一[11]。研究显示心衰代偿期肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活，引起线粒体生物合成增强，线粒体密度增加，以代偿性满足心肌代谢的能量需求，然而随着心衰进展，线粒体生物合成钝化、受损，线粒体形态异常、变性、坏死，心衰转为失代偿[12]。线粒体生物合成是一种自我保护机制，通过合成线粒体维持自身结构、功能和数量的稳定,以保证细胞线粒体正常的代谢过程[13]。线粒体生物合成与凋亡的关系密切，促进线粒体生物合成可抑制细胞凋亡，反之，抑制线粒体生物合成可诱导细胞凋亡，线粒体介导的细胞凋亡是重要的凋亡机制之一[2-4]。近期研究表明，促进线粒体生物合成的策略可明显防治心力衰竭[14-15]。
ECH 是苯乙醇苷类化合物，从我国传统中药肉苁蓉中提取，近来大量研究证实其具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗肿瘤等药理作用[16-17]，但研究主要集中于神经系统及肿瘤。本研究证实ECH 可改善心力衰竭大鼠心功能，与文献结果具有一致性，且补充了ECH治疗心力衰竭研究的实验证据。如前所述，线粒体生物合成及凋亡与心力衰竭关系密切，而信号通路PGC-1/NRFs 及其下游分子TFAM 是线粒体生物合成的关键通路。因此，本研究进一步探讨了ECH对凋亡相关蛋白及信号通路PGC-1/NRFs 的表达影响，结果显示HF 组凋亡保护蛋白Bcl-2 的表达明显减低，促凋亡蛋白Bax 明显上调，且线粒体生物合成相关基因 PGC-1、NFR-1、NFR-2、TFAM 的 mRNA表达明显下调，而ECH 干预时可逆转HF 模型中的这种改变。与HF 组相比，ECH 组凋亡保护蛋白Bcl-2的表达明显上调，促凋亡蛋白Bax 下调，且明显上调线粒体生物合成相关基因的表达，并且形态规则的线粒体增加，线粒体变性率减少。这些结果提示，ECH可能通过上调PGC-1/NRFs 信号通路促进线粒体生物合成而抑制心肌细胞凋亡，进而改善心功能。然而，心力衰竭是一个极其复杂的病理生理过程，ECH改善心功能及其对凋亡及线粒体生物合成的分子机制尚需进一步研究，阐明ECH 的作用机制将为研发新型的抗心力衰竭药物提供实验依据。
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