朱亚文，易跃能，易剑平，付 猛，魏丹丹
（1.湖南易能生物医药有限公司，湖南 长沙 410007；
2.北京同仁堂研究院，北京 100079）
白果又名平仲果、银杏、鸭脚子[1]，为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥成熟种子。白果仁为除去硬壳的种仁，始载于《绍兴本草》。《本草纲目》与《滇南本草》收载其可作为药用[2]。白果仁具有敛肺定喘、止带缩尿之功效，可用于治疗肾咳、膀胱咳、带下白浊、遗尿尿频。明代著名医家王肯堂认为：“肾虚不纳，水寒射肺而为肾咳；
……，肾失摄纳影响膀胱，膀胱气化不利影响肺之气化，称为膀胱咳”[3]。故其可用于治疗肾咳。《傅青主女科》应用白果治疗黄带下、妇人下焦寒湿不孕、肾虚腰痛遗尿等症[4]。现代药理学研究[5-8]表明，白果仁具有抗氧化、抗炎、保护神经、抗肿瘤、抗菌、止喘等多种药理作用。
白果仁中含有黄酮类、萜内酯类、酚酸类等多种有效成分，其中黄酮类成分有银杏双黄酮、异银杏黄素、金松双黄酮、银杏黄素、松柏苷、甘草苷、腺苷、熊果酸等，萜内酯类成分有银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯M、银杏内酯J、白果内酯等[5-9]。
白果仁配方颗粒以白果药材为原料，经炮制、水提、浓缩、干燥等工序制备而成。市场上白果仁配方颗粒生产厂家繁多，质量参差不齐，为保证其疗效，规范生产，需对产品进行质量控制。本实验从薄层色谱、特征图谱及松柏苷的含量等方面进行了研究，旨在为本品质量控制提供参考。
1.1 仪器 Waters 2695-2996高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（PDA）和低温柱温箱（美国Waters公司）；
BSA124S电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；
AUW120D电子天平（日本岛津公司）；
KQ-500DB超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.2 试药 白果仁配方颗粒（批号：Z279CPSY16，Z279CPSY17，Z279CPSY18）购于北京康仁堂药业有限公司；
15批白果药材分别来源于江苏泰州市泰兴市、江苏南通市海安县、山东省临沂市郯城县（见表1），全部经湖南省药品检验院方石林主任药师鉴定为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥成熟种子；
银杏内酯A对照品（批号：11862-201612）、银杏内酯C（批号：110864-201809）均购于中国食品药品检定研究院；
松柏苷（批号：AF21072402，纯度≥98.0%）购于成都埃法生物科技有限公司；
青岛海洋化工有限公司硅胶G板（规格：100 mm×100 mm；
批号：20210807）；
乙腈、甲醇（色谱纯）购于天地人生物科技有限公司；
超纯水购于屈臣氏商标有限公司；
其他试剂均为分析纯。
表1 15 批药材信息表
2.1 薄层鉴别
2.1.1 供试品溶液的制备 取白果仁配方颗粒约10 g，研细，加甲醇40 mL，加热回流1 h，滤过，滤液回收溶剂至干。残渣加水15 mL使溶解，滤过，滤液通过聚酰胺柱（80～100目，3 g，内径为10～15 mm），用水70 mL洗脱，收集洗脱液，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次40 mL，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干。残渣加甲醇1 mL使溶解，即得。
2.1.2 对照品溶液的制备 取银杏内酯A对照品、银杏内酯C对照品，分别加甲醇制成每1 mL含0.5 mg、1 mg的溶液，即得。
2.1.3 阴性对照品溶液的制备 取缺白果仁阴性对照品颗粒，照“2.1.1”制备方法制备缺白果仁阴性对照溶液。
2.1.4 薄层鉴别方法 照2020年版《中华人民共和国药典》通则0502薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各10 μL，分别点于同一含4%醋酸钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙酸乙酯-甲醇（体积比为10∶20∶5∶0.6）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐，在140～160 ℃加热30 min，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，而缺白果仁阴性对照品无干扰。（见图1）
图1 薄层鉴别色谱图
2.2 含量测定与特征图谱
2.2.1 色谱条件 Agilent 5TC-C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～3 min，10%A；
3～8 min，10%A→15%A；
8～20 min（15%A→20%A）；
检测波长为255 nm；
流速为1 mL/min；
柱温为20 ℃；
进样体积为20 μL。
2.2.2 溶液的制备
2.2.2.1 对照品溶液的制备 取松柏苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。
2.2.2.2 对照药材溶液的制备 取白果对照药材1.0 g，置具塞锥形瓶中，加水50 mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加70%甲醇10 mL，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）20 min，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.2.3 供试品溶液的制备 取白果仁配方颗粒适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.2.4 阴性对照溶液的制备 取糊精按白果仁配方颗粒工艺制备颗粒，取糊精颗粒，研细，取约0.1g，精密称定，按“2.2.2.3”中制备方法制备白果仁配方颗粒阴性对照溶液。
2.2.2.5 空白溶液的制备 取70%甲醇25 mL，置具塞锥形瓶中，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 特征图谱
2.2.3.1 精密度试验 分别精密吸取供试品（批号：Z279CPSY17）溶液，按照“2.2.1”色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以松柏苷峰为参照峰；
计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各特征峰相对保留时间的RSD均小于1%，相对峰面积的RSD均小于2%（n=6），方法精密度良好。
2.2.3.2 稳定性试验 取供试品（批号：Z279CPSY17）溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、18、24 h，按“2.2.1”色谱条件测定，以松柏苷峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各特征峰相对保留时间的RSD均小于1%，相对峰面积的RSD均小于3%，表明供试品溶液在室温放置24 h基本稳定。
2.2.3.3 重复性试验 取白果仁配方颗粒（批号：Z279CPSY17）适量，研细，取0.5 g，精密称定，按照“2.2.2.3”方法制备6份供试品溶液，按“2.2.1”色谱方法测定，记录色谱图，以松柏苷峰为参照峰；
计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各特征峰相对保留时间的RSD均小于1%，相对峰面积的RSD均小于2%（n=6），方法重复性良好。
2.2.3.4 特征图谱的建立 取15批白果药材经炮制、水提、浓缩、冷冻干燥等工序制备15批白果仁标准汤剂（冻干粉）。按“2.2.1”色谱条件测定，15批白果仁标准汤剂（冻干粉）、3批白果仁配方颗粒和对照药材HPLC叠加特征图谱见图2，对照特征图谱见图3。3批白果仁配方颗粒呈现与15批白果仁标准汤剂（冻干粉）、对照药材一致的5个明显的峰，经指认峰2为松柏苷，且峰响应值较高，故以峰2松柏苷作为S峰。供试品色谱中呈现5个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的5个特征峰保留时间相对应，与松柏苷参照物峰相对应的峰为S峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10%范围之内，规定值为：0.72（峰1）、1.10（峰3）、1.18（峰4）、1.25（峰5）。
图2 15 批白果仁标准汤剂（冻干粉）、3 批白果仁配方颗粒和对照药材HPLC 重叠特征图谱
图3 白果仁配方颗粒HPLC 对照特征图谱
2.2.4 含量测定
2.2.4.1 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、空白溶液、阴性对照溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按“2.2.1”方法测定，即得。结果白果仁配方颗粒与对照品溶液的保留时间一致，阴性对照、空白溶液在目标物保留时间附近无干扰，专属性符合要求。（见图4）
2.2.4.2 线性关系考察 取质量浓度为106.5 μg/mL的松柏苷对照品贮备液，分别稀释至质量浓度为53.25、26.62、10.65、5.32、1.065 μg/mL的对照品溶液，进样，测定。以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行回归分析，松柏苷的回归方程为：Y=60 224.369 1X-14 062.298 0，r=1.000，结果表明松柏苷在1.065～106.5 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.2.4.3 精密度试验 取同一份供试品溶液（批号：Z279CPSY17），按照“2.2.1”色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算松柏苷峰面积RSD为0.4%，表明本方法仪器精密度良好。
2.2.4.4 稳定性试验 取白果仁配方颗粒（批号：Z279CPSY17）适量，研细，取0.5 g，按照“2.2.2.3”方法制备供试品溶液，取供试品溶液于0、2、4、8、12、18、24 h分别进样，记录色谱峰面积，计算松柏苷峰面积RSD值为1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.2.4.5 重复性试验 取白果仁配方颗粒（批号：Z279CPSY17）适量，研细，取0.5 g，精密称定，按照“2.2.2.3”方法制备6份供试品溶液，按“2.2.1”色谱条件测定，记录色谱图，计算松柏苷的平均含量为0.55 mg/g，RSD值为1.4%，表明本方法重复性良好。
2.2.4.6 加样回收率试验 取白果仁配方颗粒（批号：Z279C PSY17）适量，研细，取0.25 g，6份，精密称定，分别加入同一浓度（相当于100%浓度水平）的松柏苷对照品溶液，按照“2.2.2.3”方法平行制备6份供试品溶液。按“2.2.1”色谱条件测定，计算加样平均回收率为101.6%，RSD为1.6%，表明本方法准确度良好。（见表2）
表2 松柏苷加样回收率试验结果
2.2.4.7 含量测定 取15批白果仁标准汤剂（冻干粉）和3批白果仁配方颗粒适量，分别按“2.2.2.3”方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，测定，记录峰面积，计算样品含量。（见表3）
表3 18 批样品含量测定结果
白果药材在2020年版《中华人民共和国药典》中虽有记载，但无含量测定要求。白果中黄酮及萜内酯类成分等具有抗自由基氧化、抗炎的药理作用；
松柏苷为白果中黄酮类成分，也是活性成分，具有较好的抗氧化、抑菌、抗病毒活性，且含量相对较高。
结合文献[10-15]资料，本研究以松柏苷作为含量测定指标，对白果仁配方颗粒进行含量研究和特征图谱研究，分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等不同流动相系统的洗脱效果，结果表明以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相时，对照品峰型最佳，与前后组分峰分离度最好，其他特征峰的峰形、分离度最佳，且特征图谱峰信息较全面。同时在此色谱条件下松柏苷含量测定方法准确度高、专属性强、重现性好。
为使配方颗粒更好的表达中药材的特征，本研究从药材、饮片、标准汤剂（冻干粉）、干膏粉、配方颗粒进行全过程监控。本研究通过对15批白果仁标准汤剂（冻干粉）和3批白果仁配方颗粒的检测，结果显示15批白果仁标准汤剂（冻干粉）松柏苷平均含量为0.87 mg/g，含量范围在0.42～1.24 mg/g之间，±3SD含量范围0.20～1.53 mg/g。15批白果仁标准汤剂（冻干粉）特征图谱含有5个特征峰，与松柏苷参照物峰相对应的峰为S峰。本研究计算了峰1、峰3、峰4、峰5与S峰的相对保留时间，结果显示其相对保留时间在平均值的±10%范围之内。3批配方颗粒松柏苷含量均在白果仁标准汤剂（冻干粉）的可接受范围（0.42～1.24 mg/g）之内。
白果仁中内酯类成分银杏内酯A、银杏内酯C也有一定的药效作用，但其水溶性较差，在样品中含量较低，故本研究未将其列入含量测定指标，但对薄层色谱进行了研究。结果表明，15批白果仁标准汤剂（冻干粉）和3批白果仁配方颗粒薄层色谱图均与银杏内酯A对照品、银杏内酯C对照品在相应位置上显相同颜色的斑点，且斑点显色清晰，分离度佳，可用于白果仁配方颗粒薄层鉴别。
白果新酸、氢化白果酸、十七烷一烯银杏酸、十七烷二烯银杏酸、白果酸等银杏酸是一种物理性质丰富的酚酸类物质，存在于银杏种实（外种皮、胚乳、种胚）中，是导致银杏及其制品中出现中毒和过敏反应的主要物质之一，但其在温度41～42 ℃时会分解[16]。2020年版《中华人民共和国药典》中规定银杏叶提取物的总银杏酸不得过5 mg/kg，但对白果药材及其饮片中总银杏酸的限量未作规定[17]。本试验对15批白果仁标准汤剂（冻干粉）和3批白果仁配方颗粒中总银杏酸的含量进行了研究，18批次样品中，均未检测到总银杏酸，分析原因可能是高温煎煮的时间较长，银杏酸分子由于不耐热分解，从而导致总银杏酸含量明显降低。
本研究对白果仁配方颗粒质量进行了较为全面的研究：筛选出的HPLC色谱条件检测指标成分准确度高、特征图谱专属性强、重现性好；
优选的薄层鉴别方法重现性好，耐用性好，以上研究结果能为白果仁配方颗粒质量标准的建立提供科学依据。