金一鸣, 高 娜, 门学千, 向国卿
(辽宁省肿瘤医院 内镜科, 辽宁 沈阳, 110042)
结直肠癌(CRC)是最普遍的恶性肿瘤之一，主要影响患者胃肠道，尤其是结肠、直肠和盲肠[1]。饮食习惯、炎症反应、DNA改变、遗传多态性、基因-环境相互作用和微生物群组成的变化等被认为是CRC发展的潜在危险因素[2]。尽管诊断和治疗技术不断改进，但许多CRC患者的临床结果和预后仍然较差[3]。此外，可用于准确预测早期CRC的可靠标志物较少，使其诊断和治疗具有一定难度[4]。微小RNA(miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸的小型非编码单链RNA, 在肿瘤的发生、转移中发挥重要作用。miRNA表达的改变与包括CRC在内的各种癌症之间有密切关系[5], 故miRNA可能对CRC患者具有重要的诊断和预后价值。研究[6]表明, miR-98-3p在肺癌、肝癌等多种肿瘤组织和细胞中呈低表达，并在肿瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥负性调控作用。miR-98在结肠癌患者的癌组织中低表达，与肿瘤恶性程度呈负相关[7]。DNA损伤结合蛋白1和CUL4相关因子(DCAF)家族可通过对其靶蛋白进行泛素化修饰，实现对细胞生长、分化、凋亡等生命活动的调控。其中, DCAF7是DCAF家族蛋白的主要成员之一, DCAF7主要参与调控细胞增殖分化[8], 但目前关于DCAF7在结直肠癌中表达的研究较少。因此，本研究通过检测结直肠癌组织中DCAF7、miR-98-3p的表达情况，探讨二者在结直肠癌组织中的作用及与临床病理特征的相关性，现报告如下。
1.1 一般资料
选取2017年6月—2018年6月辽宁省肿瘤医院收治的结直肠癌患者70例为研究对象，收集其术中切除的结直肠癌组织及癌旁正常组织。70例患者中男32例，女38例，年龄30～52岁，平均(37.50±1.40)岁。纳入标准: ① 经影像学检查、病理检查确诊为结直肠癌的患者; ② 首发肿瘤者; ③ 病理资料完整者。排除标准: ① 严重心、肝、肾疾病，以及感染性疾病、其他恶性肿瘤患者; ② 术前接受过放疗、化疗及生物治疗者。本研究所有患者及家属均被告知，并获得患者的知情同意。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。
1.2 方法
1.2.1 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测组织中miR-98-3p水平: 使用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)提取组织中总RNA，使用分光光度计(NanoDrop Technologies，美国)对RNA进行定量，并进行逆转录得到cDNA(逆转录反应程序为16 ℃ 30 min, 42 ℃ 42 min, 85 ℃ 5 min)。该cDNA作为RNA扩增的模板，采用qRT-PCR法对miR-98-3p进行扩增(qRT-PCR反应程序为94 ℃ 5 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s, 共设40个循环), miR-98-3p以U6作为内参，使用2-△△Ct方法对mRNA水平进行定量分析。miR-98-3p及内参引物序列见表1。miR-98-3p以患者的肿瘤组织相对表达水平中位数为临界值，超过该范围则判定为高表达。
表1 qRT-PCR引物序列
1.2.2 免疫组织化学染色观察组织中DCAF7蛋白表达: 所有手术切除标本的石蜡包埋块被切成4 μm厚的切片，并安装在载玻片上。切片使用二甲苯脱蜡并在酒精中脱水。将组织切片与0.3%过氧化氢孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶活性。然后进行抗原修复，组织切片在微波炉中10 mmol/L柠檬酸缓冲液中煮沸10 min后，用10%正常兔血清缓冲液孵育20 min以阻断非特异性结合位点。柠檬酸修复抗原后，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次3 min, 加入一抗(DCAF7兔多克隆抗体)4 ℃孵育过夜。PBS冲洗，加入二抗37 ℃孵育15 min, 进行DAB染色以及苏木精复染后脱水、透明、封片。根据切片的染色强度以及阳性细胞百分比进行评分: 0分为无阳性细胞; ≤25%的阳性细胞为1分; >25%～50%阳性细胞为2分, >50%阳性细胞为3分。染色强度: 无染色为0分，浅黄色为1分，黄褐色为2分，深褐色为3分。综合计分为以上2种评分相加, ≤3分判定为阴性, >3分判定为阳性。
1.2.3 Western blot法检测DCAF7蛋白水平: 用RIPA裂解缓冲液(Pierce, 美国)裂解组织样本，然后收集裂解液，用BCA蛋白检测试剂盒(碧云天生物科技有限公司，中国)定量。使用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质后，转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜在室温下在3%脱脂奶粉中封闭30 min, 随后与一抗DCAF7(1∶1 000, Sigma-Aldrich, 美国)和GAPDH(1∶5 000, Proteintech, 中国)4 ℃孵育过夜，洗膜缓冲液(TBST)清洗10 min, 然后加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(1∶10 000, 苏州赛维斯生物科技有限公司，中国)室温1 h。检测使用ECL蛋白质印迹检测试剂(美国密理博)进行，将印迹的特定蛋白质表达水平标准化为GAPDH。Image J软件用于分析条带密度。
1.3 统计学分析
2.1 结直肠癌组织及癌旁组织中DCAF7蛋白的表达情况
结直肠癌组织中DCAF7蛋白的阳性表达率为71.43%(50/70), 癌旁组织中阳性表达率为8.57%(6/70), 差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。
A: 结直肠癌组织; B: 癌旁组织。
表2 结直肠癌组织及癌旁组织中DCAF7蛋白阳性表达情况
2.2 结直肠癌组织及癌旁组织中DCAF7蛋白水平
结直肠癌患者癌组织中DCAF7蛋白的表达水平为(0.61±0.11), 高于癌旁组织的(0.19±0.02), 差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。
2.3 结直肠癌组织及癌旁组织中miR-98-3p水平比较
结直肠癌组织中miR-98-3p表达水平为(1.93±0.34), 低于癌旁组织的(3.67±0.71), 差异有统计学意义(P<0.05)。
2.4 结直肠癌患者癌组织中DCAF7、miR-98-3p表达的相关性
分析结果显示，结直肠癌患者癌组织中DCAF7、miR-98-3p表达呈负相关，差异有统计学意义(r=-0.376,P<0.05)。见图3。
2.5 DCAF7蛋白和miR-98-3p表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系
结果显示，结直肠癌患者癌组织中DCAF7蛋白的表达与患者性别、年龄以及肿瘤直径、肿瘤位置、浸润程度无关(P>0.05), 与淋巴结转移、TNM分期和分化程度有关(P<0.05); miR-98-3p表达与患者的性别、年龄、浸润程度以及肿瘤位置无关(P>0.05), 与TNM分期、淋巴结转移、肿瘤直径和分化程度有关(P<0.05)。见表3。
2.6 结直肠癌组织中DCAF7蛋白和miR-98-3p
水平对结直肠癌的诊断价值
ROC曲线显示，外周血DCAF7蛋白和miR-98-3p含量评估结直肠癌的曲线下面积(AUC)分别为0.864(95%CI: 0.796～0.916)、0.835(95%CI: 0.763～0.892), 对应的敏感度分别为82.86%、90.00%, 特异度分别为78.57%、68.57%。二者联合评估结直肠癌的AUC为0.952(95%CI: 0.902～0.981), 敏感度为97.14%, 特异度为77.14%。见图4。
表3 结直肠癌组织中DCAF7蛋白、miR-98-3p的表达与临床病理参数的关系
CRC是全球第三大最常见的癌症类型[9]。结直肠癌的发生发展与生活方式、遗传因素、结直肠腺瘤密切相关。该病的病因与个体基因突变有关，包括不同类型的染色体突变和DNA错配修复[10]。近年来，新的治疗方法和诊断技术的开发和应用，显著降低了CRC的病死率。然而, CRC的发病机制尚不完全清楚。
miRNA在细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用，其异常表达与肿瘤的发生发展有密切关系[11]。研究[12-14]表明, CRC中miR-143和miR-145表达显著下调，提示miRNA可能成为CRC治疗中潜在的基因治疗靶点。研究[15]表明, miR-98在多种肿瘤中呈低表达，与口腔鳞状细胞癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌等的转移有关，例如miR-98通过靶向一型胰岛素样生长因子受体(IGF1R)表达来抑制口腔鳞状细胞癌的增殖和转移。此外, miR-98通过下调整合素B3(ITGB3)抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭。miR-98-3p是miR-98家族重要成员，在本研究中，结直肠癌组织中miR-98-3p水平低于癌旁组织，结直肠癌患者癌组织中miR-98-3p表达水平与患者年龄、性别、肿瘤位置和浸润程度无关，与TNM分期、分化程度、肿瘤直径以及淋巴结转移有关。上述结果提示miR-98-3p与结直肠癌的恶性程度相关，并参与结肠癌的发生发展进程。
DCAF蛋白家族是机体维持正常生长发育的重要蛋白质家族，参与细胞增殖分化、凋亡等一系列调控，该家族已累计发现60种蛋白，其蛋白过表达或缺失与临床许多肿瘤、发育障碍等的发生发展关系密切，为肿瘤的临床治疗提供更多方向[7]。磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)是调节细胞增殖和分化之间平衡的一个重要激酶。研究[16]发现, DCAF7与DYRK1A互相作用，参与维持其稳定性。但目前关于DCAF7在结肠癌中的研究较少。本研究中，结直肠癌组织中DCAF7蛋白水平显著高于癌旁组织，结直肠癌组织中DCAF7蛋白阳性表达率为71.43%, 癌旁组织中DCAF7阳性表达率为8.57%; 结直肠癌患者癌组织中DCAF7蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径和浸润程度无相关性，与TNM分期、淋巴结转移以及分化程度有相关性，提示DCAF7蛋白也与结直肠癌的恶性程度相关。研究进一步发现，结直肠癌组织中DCAF7与miR-98-3p表达水平呈明显负相关，推测二者之间存在某种负调控关系，共同参与结直肠癌的发生发展。ROC曲线显示，外周血DCAF7蛋白和miR-98-3p含量评估结直肠癌的AUC分别为0.864、0.835, 对应的敏感度分别为82.86%、90.00%, 特异度分别为78.57%、68.57%。二者联合评估结直肠癌的AUC为0.952, 敏感度为97.14%, 特异度为77.14%。这表明DCAF7与miR-98-3p有望成为结直肠癌诊断的潜在指标。
综上所述, DCAF7在结直肠癌组织中高表达, miR-98-3p呈低表达，二者呈负相关，可作为判断结直肠癌患者病情发展的潜在生物指标，二者的表达可对患者临床病理特征进行一定的判断分析，但二者在结直肠癌患者中的确切机制有待进一步研究。
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