刘婷婷，杨 寒，吴祯倩，许 燕，许伯慧*
（南通大学药学院，南通 226001）
RNA 干扰技术（RNA interfering，RNAi）自1998年被A.Z.FIRE 和C.C.MELLO 两位科学家发现，并于2006 年获得诺贝尔生理学或医学奖后，目前已有产品获批上市[1]。近年来，RNAi 成为基因药物研究和开发的热点和重点，具有广阔的临床应用前景。其中，小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）可以根据致病基因mRNA 的基因序列进行人工设计合成，因而应用最为广泛。siRNA 具有高度的序列特异性、可传播性和高效性，在罕见病、遗传病和肿瘤等治疗领域极具应用潜力[2-4]。然而，siRNA 在体内的有效递送仍然面临着极大的挑战。siRNA 在体内极易被血清中的核酸酶降解而失活，且易被网状内皮系统消除，半衰期仅15 min[5]。除此之外，siRNA 荷负电且亲水，与负电性的脂质细胞膜的亲和力差，致使其能够被细胞摄取的量极其有限[6]。因此，siRNA 的体内转运和靶细胞递送仍离不开具有潜力的核酸载体。
前期，本课题组将九聚精氨酸（nona-arginine，9R）通过二硫键（-ss-）接枝于壳聚糖（chitosan，CS）骨架合成了还原敏感型载体材料CsR（chitosan-disulfidenona-arginine）[7]。CS 是天然的阳离子碱性多糖，但在生理条件下溶解度差，转染效率低[8-9]。9R 具有高的正电荷密度，可作为基因载体，其结构上的胍基还具有溶酶体膜致孔的功能[10]。二硫键可响应胞内高浓度谷胱甘肽（glutathione，GSH）后发生断裂，快速释放siRNA[11]。基于此，本研究期望设计合成的CsR 可以构建具有良好的核酸保护能力和还原敏感响应性能的siRNA 纳米递送载体。
1.1 仪器与试药 BS124S 电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），RS-4DN 磁力搅拌器（亚速旺（上海）商贸有限公司），90plus Zeta 纳米激光粒度分析仪（美国Brookhaven Instruments 公司），OptimaTMXE-90 超高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司），Synergy H1 全功能微孔板检测仪（美国BioTek 公司），JEM-1230 透射电子显微镜（日本JEOL 公司），EPS100 核酸电泳仪、HE120 水平电泳槽（上海天能科技有限公司）。
CsR（实验室自制），三聚磷酸钠（sodium triphosphate，TPP），上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析纯），siRNA、荧光素标记的siRNA（FAM-siRNA）、焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）处理水（百奥迈科生物技术有限公司），琼脂糖凝胶H（生工生物工程（上海）股份有限公司），纯水由Millipore 实验室超纯水机制备；
其他试剂都为化学纯试剂。
1.2 实验方法
1.2.1 CsR/siRNA 纳米粒（nanoparticles，NPs）的制备方法 以TPP 为聚阴离子胶凝剂，采用离子胶凝法制备CsR/siRNA NPs[12]，将确定剂量的siRNA 溶解于DEPC 处理水中，滴加入相应剂量的CsR 溶液，用移液器吹打30 s 混合均匀。随后加入相应浓度的TPP溶液，吹打30 s 混合均匀，室温放置30 min，即形成CsR/siRNA NPs。
1.2.2 粒径和电位测定 将200 μL 新鲜制备的CsR/siRNA NPs 混悬液用去离子水稀释至3 mL 后置于纳米激光粒度分析仪中测定粒径、多分散系数（polydispersity，PDI）和Zeta 电位。
1.2.3 包封率（encapsulation efficiency，EE）的测定
1.2.3.1 标准曲线的制备 选用荧光标记的FAMsiRNA，通过测定荧光强度对siRNA 进行定量分析。将FAM-siRNA 用DEPC 处理水分别稀释为1、2、5、10、20、50、100 和200 ng/mL 的标准溶液，取200 μL各质量浓度标准溶液置于酶标板中，在激发波长为492 nm，发射波长为518 nm 处测定荧光强度（fluorescence intensity，FI）。将测得的FI 值对FAM-siRNA浓度（concentration，C）进行线性回归获得标准曲线方程。
1.2.3.2 EE 的测定 取500 μL 载FAM-siRNA 的CsR NPs 混悬液于1 mL 离心管中，置于超高速冷冻离心机中，在4 ℃条件下，20 000 g 离心30 min。测定上清液的荧光强度，代入标准曲线方程中求得上清液中未被包载的siRNA 的质量浓度（Cunloaded），代入公式计算EE。
其中，WsiRNA表示加入的总的siRNA 的质量（ng），Cunloaded表示未包载的siRNA 的质量浓度（ng/mL），V表示离心上清液的体积（mL）。
1.2.4 CsR/siRNA NPs 处方因素考察
1.2.4.1 CsR 用量 固定siRNA 的量不变，选取CsR 与siRNA 的质量比（w/w）分别为1:1、5:1、10:1 和20:1，选定TPP 溶液的终浓度为0.5 mmol/L，按照1.2.1项下的方法制备NPs，按照1.2.2 项下的方法测定粒径、多分散系数（polydispersity，PDI）和Zeta 电位，按照1.2.3 项下的方法测定EE。
1.2.4.2 胶凝剂TPP 的浓度 固定CsR 与siRNA的质量比为20:1，选取TPP 的浓度分别为0.1、0.5、1、5 和10 mmol/L，按照1.2.1 项下的方法制备NPs，按照1.2.2 项下的方法测定粒径、PDI 和Zeta 电位，按照1.2.3 项下的方法测定EE。
1.2.5 形态观察 将CsR/siRNA NPs 混悬液点样于铜网上，室温干燥后，置于80 kV 透射电子显微镜下观察NPs 形态。
1.2.6 CsR NPs 的siRNA 保护能力研究
1.2.6.1 结合能力实验 分别选取CsR 和siRNA 的质量比为1:1、5:1、10:1 和20:1 的处方制备NPs 进行琼脂糖凝胶电泳实验。将15 μL CsR/siRNA NPs 混悬液与6×DNA 上样缓冲液混匀后上样于含Gel Red的2%琼脂糖凝胶中，以0.5×Tris-醋酸-乙二胺四乙酸二钠（TAE）为电泳缓冲液，在100 V 电压下电泳20 min 后用紫外透射仪观察siRNA 条带的迁移情况。
1.2.6.2 抗核酸酶降解实验 分别将裸siRNA 和CsR/siRNA NPs 置于终质量浓度为0.02 mg/mL 的RNase A 溶液中，在37 ℃条件下孵化30 min，随后加入RNase 抑制剂（80 U）孵化30 min 终止反应。用1%肝素钠溶液在37 ℃条件下孵化30 min 游离NPs中的siRNA。以裸siRNA 和CsR/siRNA NPs 在DEPC 处理水中孵化为无酶对照组，相同条件孵化后游离siRNA，进行琼脂糖凝胶电泳实验，具体方法同1.2.6.1。
1.2.6.3 血清稳定性实验 分别将裸siRNA 和CsR/siRNA NPs 与50%的胎牛血清在37 ℃条件下孵化0、1、2、4、8、12 和24 h，随后用1%的肝素钠在37 ℃条件下孵化30 min 游离NPs 中的siRNA 进行琼脂糖凝胶电泳实验，具体方法同1.2.6.1。
1.2.7 CsR/siRNA NPs 还原敏感响应行为研究 将CsR/siRNA NPs 分别与终浓度为0、10 μmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L 和20 mmol/L 的GSH 在37 ℃条件下孵化45 min 后进行琼脂糖凝胶电泳实验，具体实验同1.2.6.1，观察siRNA 条带的迁移情况。
2.1 FAM-siRNA 的标准曲线 测定各浓度FAMsiRNA 溶液的荧光强度，将荧光强度值对质量浓度进行线性回归，得方程FI=17.603C+293.4，R2=0.999 4。结果表明，在质量浓度范围为1～200 ng/mL，FAMsiRNA 的荧光强度与质量浓度线性相关性良好，可以用于FAM-siRNA 的定量分析。
2.2 CsR/siRNA NPs 处方因素考察
2.2.1 CsR 用量对NPs 形成的影响 CsR 用量对NPs 的粒径、PDI、Zeta 电位和EE 的影响结果见表1。
表1 CsR 用量对NPs 粒径、PDI、Zeta 电位和EE 的影响（n=3，）
表1 CsR 用量对NPs 粒径、PDI、Zeta 电位和EE 的影响（n=3，）
2.2.2 TPP 浓度对NPs 形成的影响 TPP 浓度对NPs 的粒径、PDI、Zeta 电位和EE 的影响结果见表2。
表2 TPP 浓度对NPs 粒径、PDI、Zeta 电位和EE 的影响（n=3，）
表2 TPP 浓度对NPs 粒径、PDI、Zeta 电位和EE 的影响（n=3，）
2.3 CsR/siRNA NPs 形态考察 采用透射电子显微镜观察CsR/siRNA NPs 的形态，如图1A 所示，CsR/siRNA NPs 为边缘光滑的圆球体，粒径约200 nm。
2.4 CsR NPs 的siRNA 结合能力 选取CsR/siRNA质量比分别为1:1、5:1、10:1 和20:1 的NPs 进行凝胶阻滞实验，结果见图1B。CsR 用量较少时，siRNA 迁移出上样孔外，随着CsR 用量的增加，siRNA 条带向正极迁移的量越来越少，当CsR 与siRNA 的质量比达到20:1 时，siRNA 被完全阻滞于孔中。结果表明，CsR 具有较强的siRNA 结合能力，可高效压缩siRNA形成稳定的NPs。
2.5 抗核酸酶降解能力 裸siRNA 和CsR/siRNA NPs（20:1，w/w）分别与DEPC 处理水和RNase A 孵化后，游离siRNA 后进行琼脂糖凝胶电泳实验，结果见图1C。无酶对照组中，裸siRNA 和NPs 中的siRNA都保持完整，暴露在核酸酶中的siRNA 条带降解完全，而CsR NPs 保护的siRNA 条带仍然明亮清晰。结果表明，CsR NPs 可以有效保护siRNA 免受核酸酶降解。
2.6 血清稳定性 裸siRNA 和CsR/siRNA NPs（20:1，w/w）分别与50%胎牛血清孵化0、2、4、8、12 和24 h后，游离siRNA 进行琼脂糖凝胶电泳实验，结果如图1D。裸siRNA 与血清孵育不到4 h 即被完全降解，而CsR NPs 可以保护siRNA 在血清中至少稳定24 h。
2.7 CsR/siRNA NPs 还原敏感响应行为 CsR NPs分别与终浓度0、10 μmol/L、5、10 和20 mmol/L 的GSH 溶液在37 ℃条件下孵化45 min，NPs 响应GSH还原环境释放siRNA 的行为如图1E 所示。当GSH浓度＜10 μmol/L 时，绝大多数的siRNA 被阻滞于孔中，当GSH 浓度达到5 mmol/L 时，siRNA 条带向正极发生明显迁移，表明CsR NPs 可以响应高浓度GSH 还原环境释放siRNA。
图1 CsR/siRNA NPs 构建及性质研究结果
3.1 CS/siRNA NPs 处方因素考察 CS 和9R 分子富含正电荷，为常用的基因载体，将9R 接合于CS 骨架，可增加载体的正电荷密度，提高载体的正电性。本研究中，CsR/siRNA 纳米粒的构建采用离子胶凝法，CsR 与荷负电的siRNA 以静电力结合，聚阴离子TPP 与带正电荷的CsR 产生强烈的电性相互作用而使其交联胶凝化形成NPs。在NPs 制备过程中，CsR和TPP 的用量是NPs 的关键处方因素。
当CsR 用量较低时，随着CsR 用量的增加，NPs粒径降低，当CsR 与siRNA 质量比达到10:1 时，粒径最小，随后粒径随着CsR 用量的提高而增大。在聚阴离子浓度一定的条件下，其交联CsR 的能力一定。当CsR 浓度较低时，相对过量的TPP 易产生过度交联而形成粒径较大的NPs。随着CsR 浓度的增加，交联度相应下降，粒径降低。但当CsR 浓度进一步升高时，粒径又有增加的趋势，此时TPP 与CsR 的交联度不够，不能形成紧实的NPs 而表现为粒径增加。然而，即便在CsR 用量较低的情况下，CsR NPs的EE 依然可以达到85%左右。随着CsR 用量的增加，Zeta 电位不断升高，EE 也呈上升趋势。
TPP 浓度为0.1 mmol/L 时，聚阴离子浓度较低，其与CsR 交联不足而形成疏松的NPs 结构，因而粒径较大。当TPP 浓度达到0.5 mmol/L 时，交联形成的NPs 粒径迅速降低，形成较为致密的NPs 子。随着TPP 浓度的不断增加，形成的纳米粒子之间会产生过度交联，进而引起粒径的进一步增加。同时，Zeta 电位随着聚阴离子TPP 浓度的增加而降低。除此之外，TPP 浓度对EE 的影响与胶凝形成NPs 的程度有关，交联度较低或过高都会导致包封率下降。
3.2 CsR NPs 保护siRNA 能力的验证 琼脂糖凝胶电泳实验用于验证CsR NPs 与siRNA 的结合以及保护siRNA 抗核酸酶和血清降解的能力。CsR 与siRNA 通过静电力结合，当结合力较小时，电泳的电压差会使siRNA 从上样孔中游离出来向正极移动。当CsR 用量达到20:1 时，siRNA 则完全被阻滞于孔中，表明该处方的NPs 具有很好的siRNA 结合能力。将CsR/siRNA NPs 分别与核酸酶和血清孵化，采用荷负电的肝素钠置换载体中的siRNA，前期实验[7]证明1%肝素钠可以使CsR NPs 中的siRNA 完全游离出来。裸siRNA 在核酸酶中快速降解，条带消失，而CsR NPs中的siRNA 条带明亮，未被降解。同样，裸siRNA在血清中孵育4 h 后条带消失，几乎降解完全，而CsR NPs 保护的siRNA 可以维持稳定长达24 h。
3.3 CsR NPs 还原敏感响应行为 CsR 中的二硫键可以响应肿瘤细胞内高浓度的GSH 还原敏感环境发生断裂，其断裂的速度和程度与GSH 浓度有关。GSH 在血液循环中、细胞外基质和细胞表面的浓度很低（2～10 μmol/L），而细胞内胞质中GSH 浓度可达2～10 mmol/L。然而，肿瘤组织比正常组织具有更高的还原性，其GSH 浓度可达20 mmol/L[13-14]。琼脂糖凝胶电泳实验表明，NPs 在胞外低浓度GSH 条件下不释放siRNA，当达到胞质内高GSH 浓度时，二硫键发生断裂，siRNA 迅速从NPs 中释放出来。细胞质是siRNA 实现基因沉默的关键场所[15]，利用胞质高浓度的GSH 设计还原敏感型的纳米载体可实现siRNA 的快速释放，以获得高效的基因沉默效应。
综上所述，本课题将CsR 与TPP 通过离子胶凝法构建siRNA 纳米递送载体，当CsR 与siRNA 的质量比为20:1，胶凝剂TPP 浓度为0.5 mmol/L 时，制备得到粒径、电位和EE 均较优的NPs，透射电子显微镜观察NPs 形态为200 nm 左右的球形粒子。CsR NPs 可以与siRNA 紧密结合，使其免受核酸酶降解，并有效保护siRNA 在血清中稳定24 h。在血液和细胞外低浓度GSH 环境中，siRNA 可被稳定压缩于CsR NPs 中，而当NPs 进入胞质高浓度GSH 还原环境时，CsR 二硫键断裂，siRNA 快速释放。CsR NPs 因而具有良好的siRNA 保护能力和还原敏感响应性能，可作为siRNA 体内递送的理想纳米载体。
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