王丽伟 李银 万良红 黄云超 谭慧 胡早秀 黄秋博 田民
常规支气管镜、3D磁导航支气管镜、支气管镜针吸活检（transbronchial needle aspiration，TBNA）、超声支气管镜引导经支气管镜针吸活检（endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration，EBUS-TBNA）等支气管介入活检在胸部肿瘤的诊断和分期中意义重大，是肺癌、纵隔原发及癌性转移病变等疾病的重要检查手段[1-3]。但支气管内镜介入下获取的诊断标本，仅靠床旁肉眼观察及经验判断，其质量不能达到病理诊断的要求，从而直接影响病理确诊率。
胸部肿瘤的快速现场评估（rapid on-site evaluation，ROSE）技术由意大利锡耶纳大学Giuseppe Marciano教授首创，是指在操作现场对取得组织标本进行即时制片和染色，通过显微镜快速初步诊断，指导进一步操作的技术[4]。ROSE技术运用于活检中，可缩短操作时间、降低操作风险、提高诊断阳性率[4-5]。在胸部诊疗中的运用能有效降低部分患者因没有取到理想诊断标本不能获得病理学诊断，而不得不接受重复支气管内镜介入检查，甚至接受胸腔镜、纵膈镜、开胸活检等创伤性较大的手术的几率。
2019年10月—2020年10月，由云南省肿瘤医院胸外一科、病理科、超声医学科、麻醉科、检验科与血管外科（介入组）成员组成的胸部肿瘤支气管介入ROSE诊断小组，按照ROSE标准操作流程完成了635例患者胸部肿瘤患者支气管介入活检，现将结果报道如下。
一、研究对象
2019年10月—2020年10月于云南省肿瘤医院行常规支气管、TBNA和EBUS-TBNA联合ROSE评估患者共计635例。全部患者均为电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）或正电子发射计算机断层显像/CT确认存在肺部占位性病变、至少有1组纵隔或肺门淋巴结肿大（淋巴结短径大于10 mm）。检查前需常规行血常规、肝肾功能、凝血功能等相关检查，确认无相关禁忌。根据术前病情判断需行TBNA或EBUS-TBNA检查的患者，需完善胸部增强CT检查，部分患者需行支气管三维重建。
二、支气管介入诊断操作流程
首先根据患者CT影像学表现及病史，选择检查方式：常规支气管镜、TBNA或EBUS-TBNA检查以及是否需加做病原菌现场评估。常规支气管镜（BF-260F，Olympus，日本）检查在局麻下进行肿物的取材活检、刷检及灌洗，每次组织或细胞取出时即刻行快速现场评估。若ROSE评估结果为阳性，则结束操作；
若取材样本不满意，则立即行TBNA，穿刺针型号122（Conmed Corprotion，美国），以最易穿刺的气管内肿物或7组、4组淋巴结为优先穿刺目标，评估结果为阳性操作结束，阴性则在原部位或另选点穿刺，每个部位穿刺数不超过7 次。EBUS-TBNA（BF-UC260FW，Olympus，日本）操作在全麻下进行，选用21G穿刺针（NA-201SX-4021，Olympus，日本），穿刺淋巴结定位采用WANG氏分区法定位。每针穿刺后即行ROSE评估，结果阳性，结束操作；
阴性则换点穿刺，保证单组淋巴结获取2～3个样本，每个样本2～3张涂片。若患者身体条件不允许或者多次、多途径取材均未获得阳性标本，则停止气管镜操作。
常规支气管镜与部分TBNA在局麻下完成：患者术前空腹6 h以上行2%利多卡因进行鼻咽部喷雾麻醉后进入主气管，再分两次予以2%利多卡因10 mL行表面麻醉。EBUS-TBNA与部分TBNA采用无痛静脉麻醉，患者保持自主呼吸，面罩通气，肺功能较差患者可在喉罩辅助呼吸下完成。操作全程行心电、血压、指脉氧监测，氧气吸入。
术中出血量大于5 mL患者，可对出血点直喷1∶10 000去甲肾上腺素盐水、凝血酶或采用气管镜头端压迫止血，术后常规予云南白药胶囊口服止血。
三、ROSE流程
制片：在气管镜检查进行过程中，若为样本成型则制作印片，垂直或稍倾斜均匀用力印于载玻片上；
若为液体则制作涂片，螺旋向外铺开，避免细胞过多重叠；
灌洗液吸出后立即用单层纱布滤除黏液，用吸管吸取10 mL至离心管中，1 000 r/min离心5 min，去上清液震荡15～20 s后，做细胞涂片吹干观察。每次制作2～3张玻片，其中1张在95%乙醇溶液中固定3～5 min后联合活检标本一同送检病理科。
染色：应用浸染法行迪夫快速细胞染色液（Diff-Quik cell stain）染色，操作如下：（1）先将1～2片浸泡于迪夫A溶液中约5～10 s；
（2）将制片于磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）缓冲液的染缸中洗涤5 s；
（3）轻甩干后再将制片浸泡于迪夫B 溶液中5～10 s；
（4）在蒸馏水中水洗后干燥后即完成染色。
术前高度怀疑感染者或合并感染真菌感染者，同时行改良乳酸染色，怀疑球菌或杆菌感染行革兰染色。
操作结束后涂片使用95%乙醇固定，苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）送病理检查。可制作细胞片备免疫组化及基因检测使用。
四、ROSE结果判读
所有获取的染色涂片由2位病理科医师或检验医师在光学显微镜下阅片，快速对其形态进行认定。涂片多个淋巴细胞团或较多癌细胞，认为穿刺成功（图1、2）；
大量红细胞或有核细胞很少，则认为穿刺失败（图3、4）。发现癌细胞则认为穿刺结果阳性；
未发现癌细胞，则认为穿刺结果阴性。每例患者任何一个部位ROSE结果阳性，则认为总结果阳性；
全部部位ROSE结果阴性，则认为总结果阴性[6]。
图1 细胞（10×20）呈大小不一腺样结构，可见散在核仁（腺癌）
图2 细胞（10×20）形态不规则，呈裸核拉丝样改变（小细胞肺癌）
图3 重叠细胞（10×20）多，结构不清，背景见散在分布血红细胞
图4 重叠细胞（10×20）重叠，结构模糊，背景见血红细胞
根据不同的认定结果（包括确定恶性细胞、可疑恶性细胞、恶性细胞阴性；
标本不满意包括发现出血、坏死或黏液状的物质等）来指导气管镜的进展程度：取得理想标本则停止操作；
若不理想或者取材不准确则需调整取材部位或者取材方式继续进行。
五、ROSE相关指标观察
比较ROSE结果与最终的HE染色结果的一致性，统计ROSE样本满意度、每个淋巴结与支气管肿物钳夹和穿刺次数、取材成功率、并发症发生率。胸部肿瘤支气管介入活检常见的并发症包括出血、纵隔气肿、气胸等。出血量由支气管镜医师根据镜下表现估计：＜5 mL出血为极少量，5～20 mL为轻度，20～100 mL为中度，＞ 100 mL为重度，轻度及以上出血认为是并发症[7]。对未确诊患者后续诊疗及最终病理结果进行随访。
六、统计学分析
使用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。
一、患者一般资料、检查及取材情况
全组635例患者中，男415例，女220例，年龄最大78岁，最小27岁，平均（52.4±13.2）岁；
常规支气管镜330例，常规支气管镜中转TBNA 12例，TBNA 30例，EBUS-TBNA 215例；
肿瘤直径为（3.3±1.4）cm，肿大淋巴结的短径为（1.9±0.3）cm；
取样来自肺部肿物360例，淋巴结250例；
取材方式：单纯钳夹215例，钳夹+刷检60例，刷检+灌洗70例，灌洗+钳夹、刷检或穿刺60例，穿刺230例；
送微生物培养加药敏鉴定160例。
麻醉方式：局麻381例，静脉全麻243例（其中11例为喉罩辅助呼吸）。
全组635例中70例为首次病理结果为可疑恶性、行二次检查患者。
二、ROSE诊断率与HE染色结果
全组635例患者，取材满意率93.7%（594/635）；
确诊为恶性肿瘤485例（其中肺癌395例、转移性癌40例、淋巴瘤30例、其他20例），结核20例，结节病10例，感染105例（其中单纯感染14例，肿瘤合并感染7例），阴性结果10例。
本研究中ROSE诊断结果与HE染色病理结果一致性93.7%（119/127）；
恶性肿瘤的ROSE诊断与最终HE染色病理确诊的符合率94.8%（92/97），未出现假阳性的结果，假阴性率2.4%（15/635）。确诊恶性中ROSE结果与HE染色病理结合不一致者为25例：5 例为未找到肿瘤细胞，5例为可见可疑核异质细胞而未明确诊断，病理科医师建议再次取材明确诊断，但均因患者身体状况不允许或家属不认可重复气管镜检查而未得到确诊；
另外15例为ROSE诊断结果为阴性患者，在HE染色中确诊为恶性，10例为腺癌，5例为鳞癌。
三、并发症观察及诊疗随访
全组肺部肿物共取材680部位，1 785次取材（钳夹和穿刺），平均穿刺数（2.6±1.9）次，取材成功率89.3%（1 588/1 785）；
纵隔淋巴结穿刺部位435部位，865针，平均穿刺数（2.0±0.4）次，穿刺成功率82.1%（710/865）；
术后出现并发症95例，发生率14.9%（95/635）：75例为气道出血（轻度出血65例，中度10例）、15例恶性呕吐（考虑为麻醉反应）、5例确诊结核患者出现术后发热，以上病例经对症治疗后恢复，未出现重度出血、气胸、纵隔出血等并发症。
25例影像学考虑为恶性可能患者，但ROSE结果与HE病理结果均为阴性，15例接受手术均确诊为恶性，其中腺癌10例，转移性癌5例；
剩余10例定期随访中。
本组70例首次非ROSE检查HE结果为可疑恶性，接受ROSE检查评估最终55例确诊为恶性，有效率78.5%（55/70），其余15例定期随访中。
近年来3D支气管模拟电磁导航支气管镜、超声气管镜广泛运用于临床，如何以最小创伤安全有效地获得高质量的样本，提供可靠的病理诊断以及为肺部靶向治疗基因突变检测提供足量的样本，ROSE技术在胸部肿瘤支气管介入活检诊断中运用的需求越发迫切[8]。
ROSE在肺介入诊疗中的运用开展较早，20世纪90年代对ROSE技术的探索性研究结果提示：有细胞学家在场时标本含有肿瘤细胞的比例由31%提升至56%[9]；
Austin等[10]对55例疑似肺癌患者行TBNA检查，25例ROSE操作，其阳性率为100%。随着细胞染色技术及支气管活检技术的发展，两项评估ROSE技术对胸部CT表现为肺门/纵隔淋巴结肿大患者诊断价值的随机对照研究结果提示：ROSE组诊断率为91.9%，非ROSE组78.1%，两组诊断率无统计学差异[4,11]。
本研究中ROSE诊断结果与HE染色病理结果一致性为93.7%，与上述研究结果相似；
但本研究未设置对照组，ROSE技术能否提高胸部肿瘤的诊断率还需大样本、随机对照研究进一步证实。本组资料中ROSE诊断出现15例假阴性，考虑可能为常规涂片只有1片HE染色发现恶性细胞，也可能是病理医师在高强度工作下的遗漏，提示最终病理诊断需以HE染色结果为准。本组病例影像学高度怀疑恶性而ROSE结果与HE病理结果均阴性的25例患者中15例经手术确诊为恶性，说明ROSE技术也有盲点，对于ROSE及HE染色均为阴性结果的高危患者，也可考虑进一步外科诊疗。
值得关注的是本组资料中70例为首次非ROSE指导检查HE结果为可疑恶性，接受ROSE检查最终55例确诊，其效率高达78.4%。提示ROSE能有效降低胸部肿瘤患者二次支气管活检率。
研究表明取材次数越多，确诊率越高，可根据取材部位和目的不同，选择适当的取材次数，仅为明确诊断推荐为3次；
若为明确肺癌分期则应穿刺4～5次，但穿刺7次后增加穿刺次数阳性率无明显增加[12]；
最近一篇系统性回顾研究中推荐为3～5次[13]。若需进一步行癌基因检测指导治疗，可适当增加取材次数。本组患者主要以明确诊断为主要，本组肺部肿物平均取材数（2.6±1.9）次，成功率89.3%；
纵隔淋巴结平均穿刺数（2.0±0.4）次，成功率82.1%，优于非ROSE文献报道中的平均穿刺数（3.7±1.6）次与（4.6±1.4）次。本组资料并发症发生率14.9%高于其他行ROSE评估文献报道，可能是其他文献仅纳入行TBNA 或EBUS-TBNA患者，而本组资料包括常规气管镜活检患者资料，并统计了其他如麻醉等并发症；
同时本组资料并未发现因为穿刺针数减少，术后出血生率较非ROSE报道减少，这与Trisolini等[11]的研究结论相似。
对于胸部肿瘤经气道取材活检至少需要多少组织才能获得足够的穿刺样本、应制备多少张涂片和切片以及穿刺针型号如何选择，才能确保获得足够的样本，目前无专家共识和循证医学指南[14-16]，ROSE评估下的气道取材标准更是空白[18-19]。本组经验是使用21 G穿刺针，取2～3条活检组织，即能制备足够的涂片用于Diff-Quik、HE染色及免疫组化，多余的组织及细胞可用收集液采集制作成细胞块以备相关癌基因检测，经ROSE的质量评估，其检测结果的代表性和可靠性更佳。本组研究中使用Diff-Quik染色，操作简单，试剂便宜、染色时间短，灵敏度及特异性较高。亦有使用快速瑞氏-姬姆萨染色、快速巴氏染色及甲苯胺染色行ROSE报道[5-6,16]，但其操作流程相对复杂，在ROSE过程中往往需要技师的帮助，有一定限制性。
将ROSE技术应用于胸部肿瘤支气管介入活检诊断，需要有经验的细胞病理学专家、超声医学科医生、麻醉科医生、胸外科医生甚至包括微生物专家级熟练的护士或技师的完美配合，才能保证ROSE诊断及支气管介入活检流程高效、快速进行。医学分工的细化，医务人员工作繁重，缺乏同时掌握病理学、超声医学、麻醉学、微生物学及气管操作的专业人员。我们的经验是由胸外科、病理科、超声医学科、麻醉科、检验科、血管外科及相关护理人员组成胸部肿瘤支气管介入ROSE诊断小组，通过组内1个月轮转，以及开办学习班即学即用开展胸部肿瘤ROSE诊断工作。2014年的一项研究[20]表明胸科医师经过3个月的细胞病理学培训后行ROSE检查，准确率可达80%，与病理学家的准确率92%相比无统计学差异。我们可以相信未来胸部肿瘤ROSE诊断技术将会得到普及。
总之，ROSE技术运用于胸部肿瘤支气管活检诊断，不仅获得样本满意度高、诊断结果与HE染色一致性高、取材成功率高，还可有效降低二次检查率，而且操作简便、安全可靠，临床推广价值巨大。
特别感谢意大利锡耶纳大学Giuseppe Marciano教授的指导！
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