吕会艳，李成城
(1. 济南市槐荫人民医院 内科，山东 济南250000；
2. 兰州大学 第一临床医学院，甘肃 兰州 730000)
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见且最具有侵袭性的炎症相关性恶性肿瘤之一，远处转移是HCC患者死亡的主要因素。转移不仅与肿瘤细胞自身生物学特性相关，还受瘤组织内微环境成分之间相互作用的驱动。在HCC中，肿瘤的基质成分主要由成纤维细胞、内皮细胞和肿瘤浸润炎细胞组成。这些细胞产生的肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)调节肿瘤细胞的活动，参与了肿瘤的发展和对各种治疗的应答。
肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)是TME的主要成分，在炎症相关癌症的进展中发挥着关键作用[1-2]。在体内，TAMs通过产生大量细胞因子、趋化因子、生长因子和基质金属蛋白酶等物质抑制适应性免疫、加速瘤细胞生长、促进瘤内血管生成和远处转移[3]，成为近年研究的热点。临床研究也发现，瘤组织样本中浸润的巨噬细胞数量及表型与患者的预后密切相关，尤其是在甲胎蛋白阴性的患者中[4]，但目前的研究结果尚存矛盾。因此，系统地了解TAMs与HCC的关系非常重要，本文就TAMs在HCC转移中的作用进行综述。
巨噬细胞主要来自于骨髓源性循环单核细胞[5]，具有极强的可塑性。除此之外，肝脏中的巨噬细胞还包括肝内固有巨噬细胞-库普弗细胞，但其可塑性较低，一般表现为免疫抑制表型。募集到组织的单核细胞受到细菌或病毒等微生物刺激时，将分化为分泌白介素6(interlukin-6, IL-6)、IL-12和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)，具有吞噬、促炎、调节稳态、激活免疫应答并破坏肿瘤细胞的M1型巨噬细胞(经典活化巨噬细胞)，发挥抑瘤活性；
与M1型巨噬细胞相反，单核细胞接受免疫复合物等物质的刺激也会分化为分泌IL-4/10/13、转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)、程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)、趋化因子家族和精氨酸酶1(arginase 1, Arg 1)，具有促进组织修复和肿瘤生长的M2型巨噬细胞(替代活化巨噬细胞)，发挥促瘤活性[6-7]。M1和M2型巨噬细胞之间的转换是一种响应微环境信号的生物学现象，称为“巨噬细胞极化”。相关证据显示，在大多数肿瘤中，TAMs的特征与M2型巨噬细胞相似[8]。而TME促使巨噬细胞分化倾斜，向促瘤方向发展[9-10]，如集落刺激因子1 (colony stimulating factor 1, CSF-1) 和 C-C基序配体2 (C-C motif ligand 2, CCL2)是两种最有效的募集巨噬细胞和M2型巨噬细胞极化的刺激因子，在肿瘤组织中高表达，通过激活骨髓细胞上磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)或Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)，促进肿瘤转移。
肿瘤转移是肿瘤细胞从原发部位逃逸，通过淋巴管道、血液循环或体腔播散到其他部位继续生长的多步骤过程[2]，主要包括：(1)原发部位脱落；
(2)脉管内入侵及外渗；
(3)转移部位的适应性生长。多项研究表明，TAMs参与了上述过程的每一阶段。
转移始于肿瘤细胞丧失固有极性，获得侵袭能力，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是这一事件的主要表现形式。TAMs分泌多种生长因子、促炎因子和酶，包括TGF-β、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、TNF-α、IL-6、IL-1β、基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase，MMPs：MMP-2、MMP-7、MMP-9 和 MMP-12)、蛋白水解酶以及血管生成调节酶环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)等，是肿瘤微环境的重要组成部分。IL-6、IL-1β和TNF-α可激活信号转导分子Smad、Wnt、PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B, PKB )、核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)及信号传导转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)信号通路，继而活化转录因子Snail家族和Twist，促使肿瘤细胞由上皮细胞型向间质细胞型转变，导致细胞间粘附力下降，瘤细胞脱落进入间质，获得易于向远处转移的能力[6]。体外实验显示，用培养M2型巨噬细胞的培养基培养HCC细胞，结果HCC细胞内TLR4/STAT3信号通路被激活，EMT标记物的表达水平升高，瘤细胞转移能力也增强[11]。在临床工作中也发现，结直肠癌患者肿瘤组织中TAMs的数量与癌细胞的Snail表达呈正相关[12]。
瘤体的快速生长需要比正常组织更多的血管提供氧气和营养物质，而瘤组织中的新生血管也成为了恶性肿瘤转移的主要途径。随着肿瘤体积的增大，TME也逐渐变为缺氧的状态。TAMs在瘤细胞缺氧或缺乏营养物质的刺激下分泌大量VEGF、TNFα、PDGF和TGF-β，引起血管内皮细胞的增生，促进新生血管形成。另外，TAMs分泌的蛋白水解酶和MMPs还可趋化上述促血管形成细胞因子到肿瘤组织，加速血管形成过程[2]。近期研究还发现，TAMs中存在一种新型的亚群，这些细胞表达酪氨酸蛋白激酶受体Tie-2，也称为血管生成素-1受体，与所有已知的血管生成素(angiogenin, Ang)(包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4)均能结合，具有显著的促血管生成活性[13]。而这些新生血管内皮细胞结构松散、基底膜不完整或缺失、管壁通透性高，为脱落瘤细胞向血管外游走提供了条件；
此外，TAMs也通过调节淋巴管内皮细胞增殖、分化，促进淋巴管形成，从而增加肿瘤淋巴管转移的风险[14]。
肿瘤细胞固有极性丧失后的顺利转移除了冲破脉管系统外，还需要松散的周围组织结构。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是肿瘤细胞迁移的主要屏障。肿瘤微环境中增加的蛋白水解酶、MMPs可直接作用于细胞间连接，使瘤细胞连接松散、基底膜破坏、ECM降解，既增加了瘤细胞的脱落能力，也为脱落瘤细胞的游走提供空间，促进瘤细胞的局部侵袭和远处转移[15]。
上述研究表明，TAMs是TME的重要组成部分，而TAMs浸润可以在不同方面促进肿瘤的生长和转移，影响患者预后。基于这些发现，以TAMs为靶点，以抑制TAMs趋化、减少瘤细胞EMT、降低肿瘤区域血管形成、抑制ECM降解为方向治疗肝癌不失为一种策略。
CSF-1是一种重要的巨噬细胞生长因子，在单核细胞趋化和M2型巨噬细胞极化过程中均发挥关键作用。与非转移性肝癌相比，转移性肝癌肝脏中 CSF-1 基因的表达水平较高[6]。Cai等[16]的研究结果显示，肝癌细胞分泌的CSF-1通过CSF1R-ERK1/2-C-Jun信号通路增加巨噬细胞同种异体移植炎症因子1(allograft inflammatory factor 1, AIF1)的表达。将AIF1与小鼠肝癌细胞(Hepal-6)和RAW264.7细胞共培养，RAW264.7细胞表达的趋化因子CXCL16将会增加，癌细胞的迁移能力增强。同样，在人类肝癌组织中，AIF1阳性的巨噬细胞与微血管浸润和TNM分期有关，并与患者的总体生存率和无病生存率相关(P=0.002)。而CSF-1R抑制剂——PLX3397可减少巨噬细胞浸润并增强放疗和免疫治疗的疗效[15]。但不同的肿瘤对CSF-1R抑制表现出不同的反应，应根据肿瘤的类型和位置给予TME靶向治疗，以阻断肿瘤进展和转移。
CCL2是另一种有效募集巨噬细胞和极化M2型巨噬细胞的刺激因子。Li等[17]采用免疫组化方法检测肿瘤组织切片发现，在两组独立的HCC患者队列中，肿瘤组织CCL2蛋白表达量相对于癌旁和非肿瘤组织均升高。与癌旁组织相比，队列Ⅰ和队列Ⅱ中分别有86.4%和74.0%的肿瘤组织显示CCL2表达增加。而且，在这两个队列中，CCL2表达量和总生存期之间呈负相关。多变量Cox风险分析也显示，肿瘤来源的CCL2是HCC总生存期的独立预测因子。若应用CCR2拮抗剂阻断CCL2/CCR2信号通路，则显示HCC小鼠移植瘤模型的肝脏肿瘤中巨噬细胞浸润减少，M2型细胞因子减少(IL-6、CCL2、G-CSF)，CD8+T和CD8+肿瘤浸润淋巴细胞增加，瘤组织生长受到抑制，肿瘤切除术后复发率也明显降低。目前，临床工作中用来治疗肝癌的药物也被发现不同程度地影响巨噬细胞的数量与表型。酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼是治疗晚期肝癌的一线药物[18]。近年研究表明，索拉非尼在抑制原位肿瘤生长的同时也会动员大量巨噬细胞进入血液，并促进巨噬细胞向M2型极化，影响肝癌的预后[19]。TG100-115作为一种新型的PI3K-γ 抑制剂，可逆转TAMs的表型、抑制肿瘤血管生成、增强细胞毒性T淋巴细胞的募集，改善肝癌的预后[20]。动物实验也证实，TG100-115可调节索拉非尼募集的巨噬细胞向M1 型转化，与索拉菲尼联用的抑瘤率(63.48%)明显高于索拉菲尼(46.09%)和TG100-115(40.87%)单药治疗[21]。Ndrg2是一种PTEN结合蛋白，阻止PTEN磷酸化，从而通过降低癌细胞的增殖和代谢以及抑制血管生成而发挥抗肿瘤功能[22]。Li等[23]通过建立野生型和Ndrg2基因缺失(Ndrg2-/-)型小鼠的肝癌模型发现，Ndrg2-/-小鼠肝癌移植瘤TAE中有较高比例的M1型巨噬细胞浸润，瘤体生长也受到显著抑制。针对这一结果该团队进一步研究表明，Ndrg2不仅参与巨噬细胞的成熟，也通过抑制NF-κB信号通路的激活调节巨噬细胞向M2型极化使TAE向促肿瘤的状态转化。
以上结果说明，在部分基础和临床研究中，通过不同方式抑制TAMs的募集和M2型巨噬细胞的极化或促进M2型巨噬细胞向M1型转化可减慢肝癌组织生长及瘤体转移，提高移植瘤小鼠和肝癌患者的生存率。
缺氧是调控肝癌微环境的关键因素[24]。Jiang等[25]报道，缺氧除了直接诱导TAMs向缺氧区域迁移外，还通过刺激肿瘤细胞合成分泌高迁移率族蛋白B1而加剧巨噬细胞向M2型极化，从而释放IL-6促进肝癌细胞发生EMT，促进肿瘤的侵袭和转移。不仅如此，缺氧还可上调Ang 2[26]，此时缺氧区具有更强的促血管生成及转移能力。Zhang等[24]研究也证明，在中度缺氧条件下TAMs会分泌更多的IL-1β。在持续严重缺氧条件下，肝癌细胞的坏死碎片激活TLR4/TRIF(TIR结构域受体)/NF-κB信号通路，进一步诱导TAMs释放IL-1β。随着肿瘤微环境中 IL-1β 的增加，由IL-1β通过COX-2诱导的HIF-1α 的合成随之增加；
另一方面，缺氧抑制HIF-1α降解，过量表达的HIF-1α随即增加了肝癌细胞EMT的速度。该团队在肝癌动物模型中也发现，IL-1β促进肝癌转移，预后不良。因此，在缺氧的肿瘤组织中，TAMs在EMT过程中发挥了重要作用，从而促进肿瘤转移。Fu等[27]从另一个角度也发现了TAMs与EMT 的关系。首先该团队从HCC肿瘤组织切片中观察到，肿瘤组织EMT明显的位置高表达CD68；
随后团队学者将肝癌细胞与巨噬细胞共培养24 h，结果发现肝癌细胞迁移侵袭能力明显增强，Snail和N-Cadherin表达上调，E-Cadherin下调。
以上多项研究证据表明TAMs可通过不同机制促进肝癌细胞发生EMT，促进肝癌转移，部分阻断这些促EMT通路也许会抑制肝癌的生长及转移。
综上所述，TAMs是TME中最关键的细胞之一，通过多种机制促进HCC的生长和转移，预期针对消除TAMs,阻止巨噬细胞浸润和抑制M1的M2表型转化进行干预是可行的。但无论是针对哪一步骤的TAMs靶向治疗，都是在间接攻击肿瘤细胞。联合TAMs靶向药物与放化疗、抗血管生成药物和免疫检查点抑制剂的方法可能对抑制肿瘤进展与转移起协同作用。但需要重视的是，巨噬细胞本属于炎性细胞，在炎症反应中，其表型的转变前期有助于破坏及吞噬病原体，后期协助炎症消退及促进伤口愈合。愈合过程中的血管生成、ECM沉积和组织重塑恰好可以被肿瘤细胞利用，促进瘤细胞生长及转移。一味地降低TAMs的数量是否会给患者带来副作用，抑制TAMs带来的益处是否绝对多于弊端还需大型随机临床对照试验来佐证。因此，鉴于巨噬细胞功能的复杂性，若能局部应用靶向TAMs的相关药物联合目前现有治疗手段或许是肝癌治疗的新方向。
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