何 柳， 曾 琳， 顾雅坤， 符 丽(中国医学科学院药用植物研究所海南分所，海南省南药资源保护与开发重点实验室， 海口 570311)
全世界龙血树属植物约227种[1]，我国6种，分布于云南、广西、海南、台湾等省份[2]。海南龙血树(DracaenacambodianaPierre ex Gagnep.)为天门冬科(Asparagaceae)龙血树属(Dracaena)乔木状常绿植物[3]，是我国中药资源龙血竭的基原物种之一[4]。野生资源在中国仅分布于海南岛西南山区和南部沿海地区，常生长于石灰岩和花岗岩的石缝中[5]，其分泌的红色树脂含丰富的黄酮类、皂苷、茋类、甾醇等化合物[6-9]，常用于止血、镇痛、消炎、活血、化瘀、生肌、敛疮等[10-12]。海南龙血树生长缓慢，喜阳耐旱[13]，且树形优美，具有较高的观赏价值，是盆栽以及园林绿化的重要树种，也是制作盆景的好素材[14-15]。由于具有重要的药用和经济价值[13,16]，而导致海南龙血树被过度采挖，其生境遭受严重破坏，野生种群急剧减少[5,17]，种群自然更新能力下降而不能更新复壮[5]，因此野生海南龙血树在中国已濒临灭绝[18]，目前被列为国家二级重点野生保护植物[19]。
超低温保存一般是指在-196 ℃的超低温条件下使保存材料的细胞物质代谢及生长活动几乎停止，以达到长期保存材料的一门生物学技术[20]，是离体保存与低温生物学相结合的产物[21]。在超低温条件下，调节和控制细胞代谢的各类酶活性受到严重的抑制，生命活动接近停止[22]。但其细胞仍具活性且不会发生遗传物质改变，从而达到长期稳定地保存植物种质资源及珍贵实验材料的目的[23-24]。超低温保存研究最早可追溯至19世纪后期[25]。1976年，Bajaj[26]发现经液氮处理的胡萝卜和烟草细胞悬浮液可培育出再生植株，此发现引起人们对超低温保存领域的广泛关注，随后此技术被广泛应用于植物种子、花粉、离体培养的茎尖、愈伤组织等材料的保存[27-33]，其中以种子形式进行超低温保存操作简单[34]。种子材料进行超低温保存的关键在于找出最佳含水量范围[35]，而最佳含水量范围因植物种类和种子脂质含量不同而往往有所差异[36-37]。如降香黄檀种子超低温保存最适含水量为12.35%[28]，马尾松种子为6.10%[38]，白木香种子为7.35%[39]，荆芥种子为3%[40]。
海南龙血树种子在低温(4 ℃)贮藏短时间内能有效解除休眠而保持较高的发芽率，但贮藏110 d后种子的萌发率开始下降[41]。目前对海南龙血树种质资源长期稳定保存的方法仍未见报道。为了能够长期稳定保存海南龙血树种质资源，对其种子超低温保存的最适含水量和最佳冷冻方式进行探索。本试验将不同含水量的海南龙血树种子进行超低温保存后测定其发芽率和生理生化活性，并通过石蜡切片观察超低温保存对其细胞结构的影响，探索海南龙血树种子超低温保存的最适含水量和最佳保存方法，为海南龙血树种质资源长期保存提供理论依据。
1.1 材 料
成熟的海南龙血树种子采自海南省万宁大洲岛，由国家南药基因资源库提供，原始含水量为38.72%，原始发芽率为52.22%，保存于4 ℃冰箱备用。选取乳白色、没有霉点的种子进行实验。
1.2 方 法
1.2.1获取不同含水量的海南龙血树种子
将海南龙血树种子放在无水硅胶中干燥6 h、14 h、36 h、50 h、80 h，获得含水量分别为31.46%、27.05%、13.05%、6.00%、4.40%的种子，以备后续试验。含水量的测定参照《中华人民共和国国家标准农作物种子检验规程》进行，选用高恒温烘干法，130 ℃烘干1 h。
1.2.2测定海南龙血树种子超低温保存发芽情况
将不同含水量的种子分别用玻璃化冷冻法、分步冷冻法、直接冷冻法进行超低温保存24 h。其中玻璃化法超低温保存是用装载液LS溶液(每升MS溶液中含2 mol甘油和0.4 mol蔗糖)于25 ℃浸泡处理种子20 min，再用玻璃化保护溶液PVS2(每升MS溶液中含30%甘油、0.4 mol蔗糖、15%聚乙二醇和15%二甲亚砜)冰浴处理种子30 min，换上预冷新鲜的PVS2后迅速投入液氮中进行超低温保存；
分步冷冻法超低温保存是用玻璃化保护溶液PVS2在4 ℃下处理种子30 min，再转移至-20 ℃冰箱中冷冻处理1 h，取出后迅速投入液氮中进行超低温保存24 h；
直接冷冻法超低温保存是将种子直接投入液氮中进行超低温保存24 h。
将种子从液氮中取出，40 ℃水浴解冻2 min，其中玻璃化冷冻法和分步冷冻法超低温保存的海南龙血树种子用US洗涤溶液(每升MS溶液中含1.2 mol蔗糖)洗涤10 min，无菌水浸泡3次，每次2 min；
直接冷冻法超低温保存的海南龙血树种子解冻后，用无菌水清洗3次，每次2 min。擦干种子表面水分，接种在无菌滤纸上，用无菌水湿润滤纸，放进人工气候培养箱中23～26 ℃、光照8 h培养，发芽后开始统计发芽率。
1.2.3测定海南龙血树种子生理生化活性
对未经超低温处理(含水量为38.72%、31.46%、27.05%、13.05%、6.00%)和经直接冷冻法超低温处理(含水量为6.00%)的海南龙血树种子进行生理生化活性测定，用考马斯亮蓝测定蛋白质含量[42]，淀粉酶试剂盒(试剂盒为南京建成生物工程研究所淀粉酶试剂盒C 016，碘-淀粉比色法)测定α-淀粉酶活性，硫代巴比妥酸测定MDA含量[43]，氮蓝四唑测定SOD活性[43]，愈创木酚测定POD活性[43]，H2O2测定CAT活性[44]。
1.2.4海南龙血树种子石蜡切片观察
将直接冷冻法超低温保存前后的海南龙血树种子(含水量为38.72%、16.42%、6.00%)分别制成石蜡切片。
1.2.5数据处理
本试验为单因子试验，试验设计3次重复，数据用SPPS 19.0统计分析软件进行Ducan法分析，用Microsoft Excel制图。
2.1 含水量对海南龙血树种子超低温保存的影响
如表1所示，对不同含水量的种子分别进行玻璃化冷冻、分步冷冻、直接冷冻超低温处理，其发芽率在一定含水量范围内，随着含水量的降低而显著升高。当种子含水量较高时，3种超低温法处理均不发芽；
种子含水量降至6.00%时，直接冷冻组发芽率最高，为73.89%，此时，3种冷冻法的发芽率差异不显著，均高于对照组；
含水量继续降至4.40%，所有处理的种子发芽率显著下降。本试验中，6.00%含水量下3种超低温保存方法处理的种子发芽率差异不显著，但以直接冷冻法为最佳，能节约保存成本、缩短入库时间，初步得出，含水量6.00%、直接冷冻法为海南龙血树种子超低温保存的最适含水量和最佳冷冻方式。
表1 含水量对海南龙血树种子超低温保存发芽率的影响Table 1 Effects of seeds moisture content on seed germination rate of Dracaena cambodiana after ultra-cryopreservation
2.2 含水量对海南龙血树种子生理生化活性的影响
基于初步结果海南龙血树种子超低温保存的最适含水量为6.00%，对含水量为38.72%、31.46%、27.05%、13.05%、6.00%的海南龙血树种子进行生理生化活性测定，探索含水量降至6.00%时对种子生理生化活性的影响。结果如图1，随着含水量的降低，种子的CAT活性和POD活性呈“N”型的变化趋势；
含水量为6.00%时，表现出较高的CAT活性和POD活性，均差异显著；
含水量为13.05%时，CAT活性、POD活性最低；
SOD活性随着含水量降低缓慢下降，直至含水量为6.00%时达到最低；
MDA含量随含水量的降低先缓慢增加后快速升高，含水量为38.72%时含量最低，6.00%时达到最高；
α-淀粉酶活性与MDA类似，随着含水量的降低呈直线式升高，含水量为38.72%时α-淀粉酶活性最低，6.00%时达到最高。
注：不同小写字母表示不同含水量下海南龙血树种子生理生化活性差异显著(p<0.05)。图1 含水量对海南龙血树种子生理生化活性的影响Fig.1 Effects of seeds moisture content on physiological and biochemical of Dracaena cambodiana seeds
2.3 直接冷冻超低温对含水量6.00%的海南龙血树种子生理生化活性的影响
最适含水量(6.00%)的海南龙血树种子经最佳超低温保存方法(直接冷冻法)处理后，对其生理生化活性进行测定，对照为未经超低温处理的含水量6.00%的海南龙血树种子。如表2所示，超低温保存后的种子POD活性较对照组显著下降，CAT活性、SOD活性、MDA含量、α-淀粉酶活性和蛋白质含量与对照相比差异不显著。
表2 直接冷冻超低温保存对海南龙血树种子生理生化的影响Table 2 Effects of direct freezing method on physiological and biochemical characteristics of Dracaena cambodiana seeds
2.4 海南龙血树种子石蜡切片观察
将直接冷冻法超低温保存前后含水量为38.72%、16.42%、6.00%的海南龙血树种子，分别制成石蜡切片，观察超低温保存前后细胞形态结构的变化。如图2所示，当含水量为38.72%时，对照组(未经超低温保存处理)种子细胞完整，细胞质未收缩，细胞壁清晰；
直接冷冻组细胞壁破碎，细胞质溶出，细胞结构严重损伤。当含水量为16.42%时，对照组细胞壁清晰，细胞质轻微收缩；
直接冷冻组大部分细胞完整，细胞壁清晰，细胞质轻微收缩，而少部分细胞损伤，细胞壁不清晰，未见细胞质溶出。当含水量为6.00%时，对照组细胞壁清晰，细胞质收缩；
直接冷冻法组细胞均完整，细胞壁清晰，细胞质收缩，少见细胞损伤，与对照组形态相比变化轻微。从石蜡切片结果中可得出，较低含水量更适合海南龙血树种子超低温保存。
注：a、b、c分别为含水量38.72%、16.42%和6.00%对照组；
A、B、C分别为含水量38.72%、16.42%和6.00%直接冷冻法超低温保存组。图2 超低温保存对海南龙血树种子细胞结构的影响(×40)Fig.2 Effects of ultra-cryopreservation on cell structure of seeds of Dracaena cambodiana(×40)
含水量是种子进行超低温长期稳定保存的关键因素，过高或过低都会降低种子超低温保存成活率[45]。本研究中，含水量6.00%比其他含水量种子超低温保存后发芽率显著高，表明适宜的含水量有利于种子进行超低温保存，这与商丽煌[34]，宋红等[46]的研究结果一致。超低温保存方法对种子冷冻后的成活率有一定的影响，不同的冷冻方法通过不同途径避免细胞内自由水形成冰晶，从而减少细胞在冷冻过程中受到伤害[34,47]。张晓宁等[48]，曾琳等[28]，顾雅坤等[47]通过比较超低温常用的保存方法，发现马尾松种子、降香黄檀种子、九里香种子的最佳冷冻方式分别为直接冷冻法、玻璃化冷冻法、分步冷冻法。本研究中，6.00%含水量的海南龙血树种子经玻璃化冷冻、分步冷冻、直接冷冻3种超低温保存方法处理的发芽率差异不显著，但直接冷冻法超低温能有效节约试验成本、试验时间[27]。
细胞的存活状态可通过观察其细胞结构是否完整来判断[34,49]。试验中，从石蜡切片中观察到，经直接冷冻超低温保存的种子，随着含水量逐渐降低，种子抗冻能力相应提高，细胞结构损伤情况得到减缓。经冷冻处理的高含水量种子，细胞结构发生不可逆转的破坏，导致丧失萌发能力；
当含水量降低至6.00%时，细胞结构上只有轻微变形，种子萌发能力未受到影响，这与发芽试验结果相对应。表明种子适当脱水能在超低温保存后获得较高的存活率[34]。
植物受到胁迫时会产生使细胞膜脂质过氧化的活性氧[50]。MDA在细胞内积累会损害细胞膜，其含量可衡量细胞膜脂质过氧化程度[51]。CAT、POD、SOD能清除活性氧以保护细胞膜不受损伤[50]。α-淀粉酶能为种子萌发生长提供能量[52]。试验中，未经超低温保存的种子随着含水量的降低，α-淀粉酶活性呈上升的变化趋势，α-淀粉酶活性升高有助于种子萌发，与发芽检测结果相对应。MDA含量随含水量的降低呈上升的变化趋势，说明脱水过程刺激种子产生了活性氧，导致MDA含量积累；
MDA会抑制细胞保护酶的活性，降低抗氧化物的含量，与SOD活性随含水量的降低呈现下降的变化趋势结果一致。随着含水量的降低，过氧化氢酶和过氧化物酶总体上呈上升的变化趋势，13.05%前变化不大，含水量降至6.00%时，脱水刺激导致活性氧增加，同时脱水胁迫又促使细胞内保护酶大量升高来清除活性氧以减少细胞膜的受损程度。试验中，经直接冷冻超低温保存后的6.00%含水量的种子POD活性降低了，表明在超低温冷冻影响下，种子抗氧化能力减弱了，这与对益智[27]种子、玉蝉花[46]种子的研究结果一致。而其他生理生化活性测定指标均与未超低温处理的种子差异不显著，说明直接冷冻法超低温保存对种子伤害不大，这与石蜡切片观察结果一致。综合分析发芽情况、石蜡切片结果及生理生化指标，表明海南龙血树种子进行超低温保存是可行的。
本试验对海南龙血树种子的超低温保存方法和最适保存含水量进行了探索，结果显示，6.00%的含水量和直接冷冻法是海南龙血树种子进行长期超低温保存的最优组合条件，为日后海南龙血树种质资源的保存提供了理论依据。
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