金 钺，陈曦艋，李洪炫，赵 宇，李新生，陈红英，王林青,2*
(1. 河南农业大学动物医学院，郑州 450002；
2. 郑州师范学院分子生物学郑州市重点实验室，郑州 450044)
伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起多种家畜和野生动物的一种急性、致死性传染病[1]。PRV 能够感染各个年龄阶段猪，引起仔猪神经症状和死亡，7 日龄以内新生仔猪死亡率高达100%，母猪繁殖障碍，以及育肥猪呼吸系统疾病。对于PR 的防制，主要开展疫苗接种以有效控制疾病。然而自2011 年底以来，中国多个省份规模化猪场的猪群中暴发了PR疫情[2-3]，严重限制着我国养猪业的健康发展。
2015 年，Palinski 等[4]和Phan 等[5]几乎同时从患病母猪和流产胎儿体内鉴定出猪圆环病毒3 型（Porcine circovirus 3，PCV3），是一种无囊膜的单股闭合环状DNA 病毒。PCV3 的基因组由2 000 个核苷酸组成，包括2 个主要的开放阅读框ORF1 和ORF2。前期研究发现，PCV3 感染与母猪繁殖障碍、猪皮炎肾病综合征、心脏和多系统炎症有关[4-5]。随后，Shen等[6]在患发热、肺炎的猪样品中检出PCV3；
Qi 等[7]对采自2015—2017 年中国7 省患有呼吸道疾病的94份猪肺组织样品进行PCV3检测，PCV3阳性率26.6%（25/94）；
Saporiti 等[8]对采自1997—2018 年患有呼吸道疾病的129 份病猪血清样品进行PCV3 检测，PCV3 阳性率6.2%（8/129）。这些调查结果提示，PCV3感染可能与呼吸道疾病相关。目前PCV3 在亚洲、欧洲及南美洲多个国家和地区相继流行[4-11]。
实时荧光 PCR（Quantitative real-time PCR,qPCR）是目前测定样品中核酸拷贝数最敏感、最准确的检测技术。qPCR 包括荧光探针PCR 和荧光染料PCR，Taqman 探针合成价格高，只适合特定目标[12]，而荧光染料如SYBR Green I，适用性广、灵敏、方便且便宜。目前，Liu 等已建立检测PRV 的Taqman 探针qPCR 方法[13]，Xu 等已建立PCV3 的SYBR Green I qPCR 检测方法[14]，但是迄今尚无同时快速检测PRV 和PCV3 的双重SYBR Green I 荧光定量PCR 方法。gE基因是PRV 的主要毒力基因之一，也是世界动物卫生组织所规定PRV 基因缺失疫苗的缺失基因[15]，因而建立靶向gE基因序列的PCR 技术，能够监测PRV 野毒感染。因此，本试验靶向PRVgE和PCV3Rep基因，设计2 对特异引物，建立一种在同一反应管中同时检测PRV 与PCV3 的快速、简便的双重SYBR Green I 荧光定量PCR 方法，以期用于PRV 野毒和PCV3 单独或者混合感染的临床检测及其流行病学调查。
1.1 病毒、菌株及临床样品
PCV3 阳性病料是由本实验室按照Xu 等[14]介绍的方法进行PCR 扩增、测序而获得。PRV、PCV2、猪细小病毒（PPV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）以及猪瘟病毒（CSFV）均由郑州市猪重大疫病防控重点实验室保存。DH5α感受态细胞购自北京康为世纪有限公司。
临床样品共78 份，采集于2017—2019 年期间河南省郑州、许昌和新乡等地市患有呼吸道疾病和繁殖障碍病猪场送检的发病猪，包括脑、肝脏、脾脏、肺、肾和淋巴结。取适量组织进行研磨，反复冻融3 次，12 000 r·min-1离心10 min。取上清液，于-80℃保存备用。
1.2 主要试剂
pMD18-T（宝生物工程有限公司）；
2×TaqMasterMix （北京康为世纪有限公司）；
DNA、RNA抽提试剂盒（生工生物工程股份有限公司）；
SanPrep ChamQ SYBR qPCR Master Mix、反转录试剂盒和DNA 凝胶回收试剂盒等购自诺唯赞生物科技有限公司。
1.3 引物的设计与合成
从 GenBank 中下载 PRVgE基因序列MH507059.1 和 MH521042.1 ， 利 用 DNAstar（version5.0）软件MegAlign 程序进行同源性分析。基于gE基因保守序列，应用Primer6.0 引物设计软件，设计1 对特异引物（表1），该引物扩增PRVgE基因片段长度为92 bp，而PCV3 特异引物则参考Xu等[14]设计的引物，引物扩增基因片段长度为138 bp。引物由奥科鼎盛（武汉）生物科技有限公司合成。
表1 本试验所用的PRV 和PCV3 引物Table 1 Primers for the detection of PRV and PCV3 in this study
1.4 PRV 和PCV3 标准品的制备
用SanPrep 柱式DNA 提取试剂盒，分别提取PRV 和PCV3 的DNA，作为PCR 模板，利用PRV和PCV3 特异引物PRV-F/R 和PCV3-F/R，按以下条件进行PCR 扩增35 个循环：95℃5 min；
95℃ 15 s , 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 20 s。将纯化的PCR 产物引入到pMD18-T 载体中，形成重组质粒pMD18-PRV 和pMD18-PCV3，作为PRV 和PCV3 的标准品。经测序确认后，用Nano-100 显微分光光度计检测标准品的浓度，并折算为copies·μL-1。
1.5 标准曲线的建立
为了寻求最佳反应条件和体系，分别对退火温度(55～65 ℃)、引物量，PRV 与PCV3 的引物浓度比（0∶10、1∶9、1∶4、3∶7、2∶3、1∶1、3∶2、7∶3、4∶1、9∶1 和10∶0）以及延伸时间进行荧光定量PCR，以明确qPCR 的最高荧光值、最低样本阈值循环数（Cq 值）。10 倍系列（10-1～10-10）稀释标准品，选取9 个稀释度（10-2～10-10）标准品为模板，且每个稀释度标准品做3 个重复，进行qPCR 扩增。以标准品拷贝数对数值作为X 轴，循环阈值（Cq 值）为Y 轴，建立标准曲线。
1.6 特异性和敏感性试验
利用优化的双重qPCR，对PRV、PCV3、PCV2、PPV、PEDV、PRRSV 以及CSFV 的核酸进行检测，以确定双重qPCR 的特异性。对8 个稀释度10-10～10-3的PRV 和PCV3 标准品及其混合标准品分别进行双重qPCR, 同时以去离子水为阴性对照, 测定PRV 和PCV3 的最低检测线。
1.7 重复性检测
对10-3、10-5和10-7不同稀释度样品进行3 次重复扩增，且在相同扩增条件下每个稀释度样品进行3 个平行试验，计算批内变异系数；
另外隔天对不同批次样品进行双重qPCR, 进行3 次重复检测，计算批间变异系数，以评价批内批间检测可重复性。
1.8 临床样品检测
对河南省郑州、许昌、新乡等地市猪场患有呼吸道疾病和繁殖障碍病猪的78 份临床样品提取DNA，采用已建立的荧光定量PCR 方法和常规PCR进行检测，比较这两种检测方法的检出率，评估其可靠性。
2.1 标准品模板的制备结果
以PRV 和PCV3 的DNA 为模板，利用PRV-F/R和PCV3-F/R 作引物，进行PCR 扩增。结果显示，扩增出约92 bp 的PRVgE基因和138 bp 的PCV3Rep（图1），克隆至pMD18-T 载体中，获得标准品（pMD18-PRV 和pMD18-PCV3）。经测序表明PCR产物是特异的，扩增的PRVgE和PCV3Rep基因片段长度分别为138 bp 和92 bp，与MH507059.1、KX898030 相应序列同源性100%。PRV 和PCV3 标准品浓度分别为113 和105 ng·μL-1；
折算为拷贝数时，分别为3.70×1010和 3.38×1010copies·μL-1。
2.2 双重qPCR 的优化与扩增结果
对单重qPCR，结果显示PRV 和PCV3 的峰值分别对应PRV 和PCV3 的Tm 值。所扩增PRV 的Tm 值为87℃，PCV3 的 Tm 值为81.5℃（图2）。
通过对双重qPCR 中PCV3 与PRV 的引物比进行摸索，结果显示，当PRV 与PCV3 的引物浓度比为1∶4 时，PRV 与PCV3 的溶解峰高低相近，最终确定了PRV 和PCV3 的双重qPCR 反应体系为：PRV上、下游引物各0.2 μL，PCV3 引物各0.8 μL，ChamQ SYBR qPCR Master Mix 酶 10 μL，PRV 与PCV3 标准阳性质粒各1 μL，补充ddH2O 至20 μL；
扩增条件为：95℃ 5 min；
95℃15 s , 62℃ 15 s, 72℃ 20 s，共35 个循环；
最终72℃延伸10 min。所扩增的PRV和PCV3 的 Tm 值分别为87℃和81.5℃(图3)。
2.3 荧光定量PCR 标准曲线的建立
分别以8 个稀释度（3.70×107～3.70×100copies·μL-1）的PRV 标准品和（3.38×107～3.38×100copies·μL-1）的PCV3 标准品为模板，按照优化的双重SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 反应条件，进行荧光定量PCR 扩增。以标准品拷贝数对数值为X 轴，Cq 为Y 轴，作出PRV 和PCV3 标准曲线（图4 和图5）。PRV 直线方程为：y= -3.389 3x+ 40.74，R2为0.998 3；
PCV3 直线方程为：y=-3.435x+41.681，R2为0.994 4，具有良好的线性相关。
2.4 敏感性、特异性试验结果
结果（图6）表明该方法具有良好特异性，PCV2、PPV、PEDV、PRRSV 和CSFV 核酸以及H2O均无特异性吸收峰值，而PRV 和PCV3 核酸荧光信号明显。
图7 结果显示PRV 的检测限为37.0 copies·μL-1，PCV3 的检测限为33.8 copies·μL-1，PRV 和PCV3 均在10-9稀释度仍出现扩增曲线[16]。
2.5 重复性试验结果
选取PRV 的3 个稀释度3.70×103、3.70×105和3.70×107copies·μL-1及PCV3 的3.38×103、3.38×105和3.38×107copies·μL-1标准品进行检测。结果显示表明该方法重复性高、稳定性良好，批内变异系数在0.32%～1.28%之间，批间变异系数在0.79%～1.68%之间。
2.6 临床样品的检测结果
对2017—2019 年采集的78 份猪样品进行检测。结果显示，PRV 阳性15 份，阳性率19.23%；
PCV3阳性32 份，阳性率41.03%；
混合感染7 份，阳性率8.97%。采用常规PCR 检测时，PRV 和PCV3 阳性率分别是14.10%（11/78）和32.05%（25/78），PRV和PCV3 混合感染率为6.41%（5/78）。表明建立的双重SYBR GreenⅠqPCR 检测方法更为灵敏。
自2011 年底以来，中国很多地区规模化猪场暴发了新一轮PR 疫情，给养猪业造成巨大经济损失。随后，中国政府于2012 年提出PR 的根除计划，虽然2013 年后PRV gE 血清抗体阳性率逐渐降低，但是现在还没有完全根除PR。PCV3 是近年来新发现的一种猪圆环病毒，已在世界范围内逐渐流行[4-11]。前期研究发现，PCV3 可能与呼吸道疾病、繁殖障碍有关[4-9]。PRV 和PCV3 感染均可导致呼吸道疾病和母猪繁殖障碍，且前期研究报道我国猪群中已存在PRV 与PCV3 的混合感染[17-18]。Zhang 等[19]报道PCV2 感染加重PRV 引起仔猪的肺和脑损伤。与PCV2 相似，PCV3 可能会导致更严重PRV 感染引起的临床症状和PRV 病变。因此，建立一种可以快速鉴别和诊断这两种病原体的方法是十分有必要的。
gE基因作为PRV 毒力基因之一，在该基因缺失后病毒依然能够复制[20]。目前我国规模化猪场广泛使用gE基因缺失PRV 疫苗，可通过gE-ELISA方法检测PRVgE 蛋白抗体来有效监测猪群中PRV野毒感染情况，但是gE-ELISA 方法费用高，耗时长，因而PRV 的检测引物靶向gE基因。PCV3 Rep与病毒复制相关，且比较保守[21]，故PCV3 的检测引物应选择Rep基因[14]。因此，本试验靶向PRVgE和PCV3Rep基因保守区，设计合成PRV 和PCV3的荧光定量PCR 检测引物，通过反应体系和扩增条件的摸索，最终建立了双重qPCR 检测方法。当PRV与PCV3 的引物浓度比为1∶4 时，PRV 和PCV3在同一反应管中均可以产生特异的溶解峰值(PRV和PCV3 的Tm 值分别为87℃和81.5℃)，而其他病原体均不出现溶解峰。PRV 的最小检测下线为37.0 copies·μL-1，略微低于Liu 等所建立的检测方法[13]；
PCV3 的最小检测值为33.8 copies·μL-1，与Han 等[22]所建立的PCV3 qPCR 方法相当。此外，批内批间变异系数均小于2%。因此，本研究所建立的双重qPCR 检测方法具有特异、敏感和重复性好的优点，可及时、准确剔除PRV 阳性的野毒感染动物，为根除、净化PR 提供技术保障，为PRV 和PCV3 的检测和防控起着很重要的作用。
本研究对2017—2019 年河南省郑州、许昌和新乡等地市患有呼吸道疾病和繁殖障碍病猪场送检的78 份临床病料样品，采用建立的双重qPCR 进行PRV 和PCV3 的检测，PRV 阳性率19.23%（15/78），表明2017—2019 年河南部分地区猪场仍存在PRV野毒感染，PR 防控形势依然严峻。PCV3 阳性率41.03%（32/78），PRV 和PCV3 混合感染率为8.97%（7/78），表明中国猪场仍存在PRV 和PCV3 感染。PRV 和PCV3 的混合感染率（8.97%）略高于Zhao等[17]报道的PRV 和PCV3 混合感染率（3.6%），这可能是由于本试验所采集的临床样本均来自患有呼吸症状和繁殖失败的病猪。鉴于PRV 感染造成的巨大经济损失、中国政府提出的PR 根除方案以及PCV3 的潜在危害，迫切需要加强对PRV 和PCV3的临床诊断和监测。
本试验建立的双重荧光PCR 检测方法具有特异、敏感、快速和准确等优点，检测时间2～3 h，适合PRV 和PCV3 的早期诊断及流行病学调查，具有较强的应用价值。本研究建立的双重荧光PCR 方法有望广泛应用于疫病病原学方面研究。
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