万琪，谢晔，王蓉，骆延，曾俊伟
半乳糖凝集素-3（Gal-3）是一种分子质量为29～35 ku的蛋白，属于结合半乳糖苷类的凝集素家族，可由其糖识别结构域（CRD）介导，识别并结合含有β-半乳糖的部分多糖配体。在巨噬细胞分布的Gal-3可通过加剧炎症反应和氧化应激，促进脂质沉积和粥样斑块形成，参与动脉粥样硬化、急性心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的进程，因此，Gal-3被认为是心血管疾病的危险标志物和治疗靶点［1-2］。此外，Gal-3也表达于哺乳动物的小胶质细胞。小胶质细胞被认为是大脑中的巨噬细胞，是中枢神经系统抵御病原微生物或伤害性刺激入侵的第一道防线，可通过诱发炎症反应并释放神经活性物质间接影响神经元功能，参与脑损伤及神经退行性疾病的进程［3］。Gal-3在阿尔茨海默病（AD）病变中的作用近年来备受关注。研究发现，海马小胶质细胞的Gal-3表达异常参与了AD患者病变脑区神经元丢失过程和以β淀粉样蛋白（Aβ）为主的淀粉样斑块形成，导致患者认知功能减退［3］。本文就近年Gal-3在神经系统的表达、相关信号通路及其参与AD的分子机制研究进展进行综述，为研发可靶向抑制Gal-3功能的药物，保护神经功能和临床治疗AD提供参考。
Gal-3基因又称可溶性半乳糖苷结合凝集素3（LGALS3）基因，位于染色体1p13及14q21-22［4］。Gal-3是由130个氨基酸组成的五聚体环状结构的蛋白质［1］，含有3个重要结构域：（1）C-端具有一个CRD和一个发挥抗凋亡作用的天冬氨酸-色氨酸-甘氨酸-精氨酸序列［5］。该序列与B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）家族同源。CRD结构域由大约135个氨基酸残基组成，对β-半乳糖苷的亲和力较强［3］。（2）N-端含约120个氨基酸，内含一个丝氨酸磷酸化位点［6］。（3）在CRD和N-端之间有一个胶原α样序列（CLS），包含约100个氨基酸，含甘氨酸-酪氨酸-脯氨酸串联重复序列［6］；
CLS的存在对于维持Gal-3五聚体形状起重要作用［3］。基质金属蛋白酶（MMP）-2/9可作用于CLS的丙氨酸62-酪氨酸63位点，将Gal-3切割为含有CRD结构域的22 ku片段和含有N末端结构域的9 ku片段［7］。常见的可结合至Gal-3启动子区域并调控其表达的转录因子有特异性蛋白1（Sp1）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）、SIS诱导元件（SIE）、核因子（NF）-κB和碱性螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH）［3］。
形态学试验观察到Gal-3表达于脊椎动物的神经系统。在外周神经系统，Gal-3表达在坐骨神经的雪旺细胞［8］、背根神经节（DRG）神经元［9］、视网膜色素上皮细胞［10］和视神经［11］。在中枢神经系统，Gal-3表达在脊髓、皮层、海马、下丘脑、尾状核、纹状体、脑室下区、小脑及胼胝体。原位杂交及免疫荧光染色技术观察到，在大脑皮层和下丘脑分布的Gal-3主要位于神经元；
在脊髓、海马、尾状核、小脑以及胼胝体分布的Gal-3主要位于小胶质细胞。在星形细胞瘤病变组织中Gal-3表达较高，而少突胶质细胞瘤病变组织中Gal-3表达较低［12］。在PC12［13］、BV2小胶质细胞［14］，Gli4［15］、T98G和U251［16］胶质瘤细胞株也有Gal-3的表达。Gal-3可在游离核糖体合成，由于缺乏控制其在经典分泌途径中移位和分泌的信号序列，因此Gal-3无法利用内质网/高尔基体分泌系统，可直接以囊泡和（或）外泌体途径进行分泌。Gal-3能通过羧基端最后28个氨基酸靶向胞核从而在胞核与胞质之间穿梭［3］，Gal-3的P（S/T）AP序列（又称为晚期结构域）可与内吞体分选转运复合体的肿瘤易感基因101蛋白组分结合，使Gal-3进入内体（一种膜包裹的囊泡结构）进而转运到细胞外基质中［17］。所以Gal-3在胞浆、胞膜和胞外均有表达。这些关于Gal-3在神经系统各部位、各细胞表达水平的形态学研究成果，对深入研究其参与神经系统病变机制具有重要意义。
Gal-3分子结构中包含有CRD、抗死亡序列以及CLS，因此可结合多种分子，通过调节下游信号发挥作用。在骨髓间充质干细胞中，Gal-3可与Gal-3结合蛋白（Gal-3BP）结合，促进Ras/丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）1/2通路激活，导致炎性因子白细胞介素（IL）-6分泌［18］。Gal-3的CRD结构域相关的信号通路主要有：（1）与Toll样受体（TLR）2/4的N-糖链结合，激活TLR/髓样分化因子（MyD88）/NF-κB-p65信号通路［19］。（2）与髓系细胞触发受体2（TREM2）胞外域的糖链以及衔接蛋白DNAX激活蛋白12（DAP12）结合形成复合体，随之促进脾酪氨酸激酶（Syk）磷酸化，发挥下游效应［20］。（3）与α3β1整合素上甘露糖苷乙酰氨基葡萄糖转移酶（MGAT）5修饰的复合物n-聚糖结合，促进整合素连接激酶磷酸化，参与细胞迁移［21］。（4）与表皮细胞生长因子或转化生长因子-β受体结合促进胞内信号转导［22］。（5）与JAG1（jagged1，一种Notch配体）结合，激活Notch通路，并与Notch1受体胞内结合域相互作用，促进其核转位［23］。（6）与糖基化的细胞表面胰岛素受体相互作用，使其酪氨酸磷酸化并抑制下游信号，引起胰岛素抵抗［24］。（7）与骨塑型蛋白受体1α结合，随后骨形态发生蛋白信号激活，促进下游Smad1/5/8的磷酸化和分化抑制因子3表达［25-26］。（8）与肌球蛋白-2A结合，增强NF-κB受体活化因子配体（RANKL）/NF-κB受体活化因子（RANK）的下游途径，抑制成骨细胞分化［27］。Gal-3的羧基端既可与β-连环蛋白（β-catenin）的氨基端结合，使其无法降解；
也可以通过磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）/糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），导致胞内β-catenin入核，促进下游靶基因表达［28］。Gal-3的NWGR基序相关的通路主要有：（1）通过NWGR基序的甘氨酸残基促进Akt、ERK和Bcl-2基因相关启动子（Bad）磷酸化，参与维持线粒体稳定，阻止细胞色素C（CytC）释放并抑制随后的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9激活，发挥抗凋亡作用［29-31］。（2）与Bcl-2相互作用，激活K-Ras蛋白，参与维持线粒体的稳定，并通过抑制CytC等促凋亡因子释放，发挥抑制凋亡作用［32］。
AD是一种神经退行性疾病，起病隐匿，病程较长，主要特征是淀粉样β斑块和tau神经原纤维缠结［3］。60%～80%的AD发病风险都源于遗传因素，现已确定40多个与之相关的遗传风险基因位点，涉及体内再循环途径、炎症和胆固醇代谢等，此外小胶质细胞的激活介导了AD病变的发生发展［20］。近年研究表明，Gal-3表达于哺乳动物的大脑皮层和海马中，是参与小胶质细胞活性调节及炎性因子生成的关键分子之一［3，7，20］。
4.1 Gal-3参与AD病变进展的临床及动物研究
4.1.1 临床研究AD患者由于病变脑区神经元丢失和Aβ沉积，出现进行性的记忆困难和认知功能障碍。有研究按照临床痴呆评定量表（CDR）评分将AD患者分为轻（CDR=1）、中（CDR=2）和重度（CDR=3）3个阶段。基因生物学分析显示，Gal-3基因多态性 变 异 增 加 了AD发 病 风 险［20］，携 带rs46443、rs46523和rs10099773等变异LGALS3基因的70～85岁老年人血清C-反应蛋白（CRP）水平显著升高，简易精神状态检查（MMSE）评分显示这些患者认知能力明显下降，提示Gal-3和炎症反应可能参与AD病变［33］。来自美国［34］、中国［35］和沙特阿拉伯［36］的临床研究表明，60岁以上AD患者血清Gal-3水平高于同龄健康人群，Gal-3含量随CDR评分的升高而上升［34-35］；
患者脑脊液Gal-3水平也高于同龄健康人群，AD患者的MMSE评分与患者血清Gal-3水平呈负相关［36］。此外，在AD患者尸检后观察到大脑额叶和颞叶皮层的Gal-3表达显著高于正常人，额叶分布的Gal-3与小型淀粉样斑块存在共表达现象，颞叶分布的Gal-3主要位于Aβ斑块周围的小胶质细胞［20，37］。这些研究表明Gal-3的异常表达参与了AD病变进展。
4.1.2 动物研究由于5xFAD转基因小鼠脑组织中，淀粉样前体蛋白（APP）和早老蛋白-1（PS1）过表达，可重现AD病变中Aβ淀粉样斑块的病理特征，常用于AD领域的研究。随着月龄（6～18个月）增加，在5xFAD转基因小鼠的大脑皮层、海马和丘脑中Gal-3表达上调并定位于Aβ斑块周围的小胶质细胞；
对Gal-3敲除的5xFAD转基因小鼠进行水迷宫实验，观察到认知/空间记忆障碍明显缓解，同时Aβ斑块形成明显减少［20］。在大鼠海马CA1区注射Aβ之后，在离子钙结合适配器分子1（Iba-1）阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞均观察到Gal-3表达上调［38］。在这些AD动物模型上，病变脑区Aβ淀粉样斑块和Gal-3表达异常的现象同时存在，为Gal-3参与AD病变进展提供了初步证据。
4.2 Gal-3参与AD病变的分子机制
4.2.1 促进Aβ寡聚体形成Aβ寡聚体大量增多是加速AD病变的一个重要因素。在动物实验中，Gal-3基因敲除小鼠的海马CA1区注射Aβ后形成的Aβ寡聚体明显减少；
在离体实验中，Gal-3与单体Aβ肽结合后荧光强度明显增加，免疫共沉淀试验证实Gal-3可以与内源性Aβ单体相结合［20］。在Gal-3过
表达小鼠CA1区注射Aβ后形成较多Aβ寡聚体，提示Gal-3的过表达促进了Aβ寡聚体形成［37］。Halim等［39］在AD患者脑脊液中检测到Aβ1-19肽的酪氨酸-10位点O型糖基化增强，Gal-3可能与Aβ肽的糖基化位点结合，促进了Aβ寡聚体形成。
4.2.2 抑制Aβ的降解Gal-3的高表达可以抑制部分Aβ降解酶的表达（活性），导致Aβ降解速度减慢。在培养的BV2小胶质细胞中加入Aβ纤维后，BV2细胞的脑啡肽酶（NEP，降解细胞外的Aβ42）和胰岛素降解酶（IDE，多位点降解Aβ）表达下降，导致Aβ的聚集；
相反，经Gal-3抑制剂和敲除Gal-3处理后BV2细胞NEP和IDE表达升高，细胞内外Aβ得到充分降解，Aβ聚集减少［20］。同样，Tao等［37］在Gal-3基因敲除的AD小鼠中发现其海马分布的NEP和IDE表达明显升高，Aβ的聚集减少，表明抑制Gal-3可发挥促Aβ降解效应，深入研究发现Gal-3表达下降可抑制整合素α3通路，间接促进黏着斑激酶（FAK）/环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）激活，CREB可结合到NEP基因启动子位点促进其转录。H4-APPsw细胞在淀粉样前体蛋白基因中引入双重瑞典突变（K595N/M596L）后可导致Aβ40和Aβ42过表达，是常用的AD细胞模型。Seki等［40］在该细胞观察到Gal-3BP可以通过降低淀粉蛋白前β-分解酶1的活性，导致淀粉样前体蛋白的裂解减少，随后Aβ分泌降低，但Gal-3BP是否能削弱Gal-3在AD中的致病作用尚不明确，因此，有关Gal-3-Gal-3BP轴与AD病变之间是否存在关联，还需针对AD患者大脑或动物模型进行深入研究。
4.2.3 促进炎症反应小胶质细胞诱发的炎症反应能够促进AD病变进展。STAT蛋白抑制剂1（PIAS1）被认为是一种具有抗炎效应的蛋白，在AD小鼠海马中PIAS1表达下降，抗炎效应减弱，而海马Gal-3表达上升往往提示较强的炎症反应，可见海马炎症反应参与AD病变［37］。研究发现，在大鼠海马CA1区注射Aβ后小胶质细胞表达Gal-3增多；
同时，Aβ寡聚体作用于人单核细胞白血病细胞（THP-1）后，炎性因子IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）表达及释放增加；
而Gal-3的表达上升可被TLR5抑制剂阻断，说明Gal-3的表达受到TLR5下游通路分子的调控［41］；
Gal-3抑制剂预处理可以明显抑制Aβ纤维刺激THP-1细胞［41］、人脐血源性间叶干细胞［42］以及Grn基因敲除的Raw巨噬细胞［43］后诱发的Gal-3、IL-12、IL-8、一氧化氮合酶、TNF-α的表达与释放［41-43］。Boza-Serrano等［20］发现，在Gal-3抑制剂作用下，BV2小胶质细胞的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体表达减少。在Gal-3敲除小鼠的皮层小胶质细胞，Aβ纤维诱导产生的IL-6、IL-8和TNF-α表达及释放也明显减少，可见Gal-3高表达促进了炎症因子的生成［43］。对海马组织进行高通量测序显示，在5xFAD转基因AD小鼠海马TLR4和TREM2/DAP12通路激活，但Gal-3基因敲除的AD小鼠海马这两条通路激活明显减弱。由于TLR4和TREM2、DAP12大多存在于在小胶质细胞，推测Gal-3导致小胶质细胞激活，诱发炎症反应的机制为Gal-3分别与TLR4和TREM2的糖链结合后并激活下游通路［20］，而免疫共沉淀试验也证实Gal-3可以与TLR4或TREM2结合［37］。
4.2.4 调节溶酶体功能溶酶体功能异常可导致Aβ降解发生障碍，提高溶酶体自噬则为一种降解患者脑内Aβ的治疗策略。在5xFAD转基因小鼠中，Gal-3和组织蛋白酶B（由溶酶体产生）表达上升且共定位于皮层小胶质细胞［43］；
在5xFAD转基因小鼠脑组织（不含小脑）的溶酶体富集分离物中也检测到Gal-3含量增加［44］。Aβ42与人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞，常用于AD细胞模型制备）共孵育之后，细胞溶酶体活性氧产生增加，免疫荧光双标记观察到Gal-3与Aβ42、溶酶体膜蛋白标志物溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）、巨噬唾液酸蛋白（CD68，一种溶酶体膜蛋白）以及溶酶体自噬标志物微管相关蛋白1轻链3β（LC-3B）表达共定位，提示活性氧生成促进溶酶体膜募集Gal-3［45］。在离体实验中，外源性Gal-3处理皮层原代小胶质细胞后，Gal-3与组织蛋白酶B（CTSB），LAMP1、CD68、LC-3等多种溶酶体蛋白表达共定位，且Gal-3和CTSB表达同步上升，由此初步推测Gal-3可促进小胶质细胞溶酶体功能增强，这有助于吞噬摄取Aβ单体，但对Aβ纤维的摄取量减少的现象，机制尚不清楚［20］。另有研究报道，海马GSK-3β活性增强可导致转录因子EB的134/138位丝氨酸位点磷酸化，进而抑制其核转位，无法启动后续的多种溶酶体膜蛋白和组织蛋白酶的转录［46］，但这种抑制效应在AD小鼠海马注射Gal-3之后解除［42］。研究表明，Gal-3通过抑制GSK-3β的活性，导致转录因子EB核转位，启动后续多种溶酶体膜蛋白和组织蛋白酶的转录，溶酶体功能增强，一定程度上增强小胶质细胞吞噬能力，但小胶质细胞吞噬过多Aβ之后，溶酶体功能障碍，影响小胶质细胞对Aβ的进一步吞噬和清除［47］。
临床上一般在AD患者出现明显的认知障碍时开始治疗，但此时Aβ的聚集和淀粉样斑块已经形成。鉴于Gal-3在AD中的致病作用已经明确，采用Gal-3抑制剂对Aβ的产生进行适度抑制，有可能产生一定的治疗效果。Gal-3的大多数下游生物学效应与CRD结构域有关，Gal-3的抑制剂主要着眼于CRD结构域进行研发。改性柑橘果胶（MCP，一种从柑橘类植物中提取的天然多糖）作为Gal-3抑制剂可减轻蛛网膜下腔出血小鼠的血脑屏障和脑损伤［48］。MCP还可以减弱高脂饮食/链脲霉素诱导的糖尿病大鼠的神经炎症、氧化应激和认知障碍。在离体试验中，MCP能明显缓解高糖刺激导致的BV-2小胶质细胞的氧化应激和炎症反应［49］。目前包括MCP在内的Gal-3抑制剂还停留在离体试验阶段，要应用于临床患者，还需要进行更多的试验以提供充足的证据支撑。
综上，分布在AD患者大脑皮层和海马等病变脑区的Gal-3表达上升，可通过增加Aβ寡聚体形成、抑制Aβ降解、促进神经炎症和影响溶酶体吞噬功能促进AD病变进展。患者血清和脑脊液Gal-3含量均随AD病变进展同步上升。因此，Gal-3可能成为检测AD病变程度的潜在生物学标志物，Gal-3抑制剂为AD的治疗提供了希望。
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