谭 顺，莫创荣，许雪棠，庞瑞林，王露洁，陆祖逸
(1.广西大学资源环境与材料学院，南宁 530004；
2.广西大学化学化工学院，南宁 530004)
【研究意义】随着我国沼气工程扩大化和规模化的实施，大量产生的沼液也逐渐成为我国污水来源的重要组成部分[1]。相关统计结果表明，我国沼气工程产生的沼液每年超过10亿t[2]。通过厌氧发酵技术处理牲畜粪便可产生沼气等清洁能源[3-4]，但发酵产生的沼液仍存在产量大、不易储存和不易达标排放等问题。沼液属于高浓度有机废水，具有含氮量高、生物降解性差及碳氮比低等特点[5]，而目前用于净化沼液的序批式反应器对沼液中污染物的去除效率仅20%左右[6]。已有研究表明，微藻生物质培养技术能实现高效脱氮除磷[7]，利用固定化污泥和固定化小球藻(Chlorella)共培养处理，经Up-flow Anaerobic Sludge Bed/Blanket(USAB)工艺处理的真实畜禽养殖废水，48 h时对氮和磷的去除率均在80%以上[8]；
利用微藻处理沼液，既能达到废水处理的目的，也能收获并创造附加值。因此，利用高氨氮沼液直接浸种强化小球藻，对实现沼液资源化利用具有重要意义。【前人研究进展】国内外学者为提高微藻在沼液中的适应性和对营养物质的去除效果，利用多种方式对微藻进行了筛选和强化。冯思然等[9]开展奶牛场沼液资源化处理研究，发现小球藻在低浓度(25%～50%)沼液中生长状态良好，对污染物有较高的去除率，同时能产生更多高能量组分的生物质，经处理的沼液适用于生物燃料开发。孙宏等[10]采用稀释5倍沼液原位富集筛选分离方法得到4株微藻，并通过比较不同微藻对沼液的处理效果确定目标微藻。Chen等[11]研究表明，小球藻在经厌氧消化的猪场废水中具有更好的生长性能、更高的废水耐受性(废水含量达100%)和更好的养分去除能力。叶庆等[12]采用经辐射诱变得到的藻种ChlorellaPY-ZU1处理沼液，获得了高效净化效果。孙盛进等[13]利用从同为高色、高浊、高盐废水垃圾渗滤液中得到的小球藻处理稀释10倍的沼液，沼液经电场预处理后，小球藻对沼液中总磷的去除率最高可达99.5%。为获得能耐受高CO2浓度并具有高CO2固定能力的微藻藻株，Li等[14]分别在10%和20% CO2条件下经过31个适应性实验室进化循环后获得2株进化小球藻，命名为藻株AE10和AE20，二者均可在高CO2条件下快速生长，其中，AE10的最大生物量浓度为3.68 g/L，分别是AE20和原藻株的1.22和2.94倍；
黄俊霖等[15]采用逐步提高沼液含量来适应性驯化小球藻，发现用50%沼液驯化后的小球藻可直接处理絮凝预处理后的沼液；
Wang等[16]也采用逐步提高沼液含量来驯化小球藻，经过5个梯度驯化，在64 L开放式水道池中可去除沼液中几乎100%的氮磷；
Li等[17]将小球藻依次接种到25%、50%、75%和100%高氮磷模拟废水中进行驯化，驯化后的小球藻生物量和叶绿素积累率及氨氮和磷的去除率显著提高。【本研究切入点】沼液的成分复杂且多变[1]，利用经沼液浓度梯度驯化后的小球藻处理不同特性沼液时，还需再次驯化小球藻，耗时且复杂，需寻找一种高效且简易的方法以强化小球藻对沼液的处理效果，但目前国内外对利用高氨氮沼液直接浸种强化小球藻作用的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】利用高氨氮沼液直接浸种小球藻，探究沼液浸种对小球藻生长、光合色素和脱氮除磷效果的影响，并利用最佳浸种时间小球藻处理实际废水以检验沼液浸种对小球藻的强化作用，以期确定沼液浸种强化小球藻的可行性，为小球藻处理沼液技术的大规模推广应用提供科学依据。
1.1 试验材料
所用微藻为实验室驯化后保存的普通小球藻(Chlorellavulgaris)，藻种编号为FACHB-8[14]。原始藻种购自中国科学院(武汉)淡水藻种库。藻种使用前用BG11培养基进行扩大培养。
猪场沼液采集于广西南宁市某养猪场厌氧发酵工艺初沉池出水处，采集后用8层纱布过滤去除不溶性大颗粒物，4 ℃冷藏保存。临用时，11 000 r/min离心10 min去除大部分小颗粒物和大部分微生物。预测定经处理沼液的相关水质指标，其化学需氧量(CODcr)为460.0 mg/L，总磷为12.3 mg/L，氨氮为1640.0 mg/L，色度为1957度，pH为8.49。
含氨氮培养基采用BG11培养基加0.45 g/L氯化铵进行设计，其氨氮初始浓度达126.3 mg/L。实际废水培养基为无硝态氮和双倍磷酸氢二钾的改良BG11培养基与含7%沼液的混合液，并加入0.27 g/L葡萄糖补充碳源，其中的总磷和氨氮初始浓度分别为11.47和120.76 mg/L。含氨氮培养基和实际废水用1.0 mol/L NaOH和HCl调节初始pH为(7.00±0.02)。
1.2 试验方法
1.2.1 试验设计 ①沼液浸种及扩培：取9.0 mL扩大培养后的藻液，4000 r/min离心8 min，去除上清，用预处理后的沼液定容至9.0 mL，摇匀，对小球藻分别进行0、4、8和12 h浸泡预处理后，接种至工作容积为400.0 mL的柱状光反应器(直径为5.0 cm，高为33.0 cm)中，培养基为BG11培养基，曝气量为1.0 L/min，光照强度为4000 lx，光暗比为24∶0，室温培养。②含氨氮培养基筛选藻种：将浸种后培养7 d的小球藻离心收集，接种至含氨氮培养基、工作容积为1.0 L的柱状光反应器(直径为6.0 cm，高为42.0 cm)中培养，培养条件与①相同。③处理实际废水：将筛选获得8 h浸种处理的小球藻培养至对数期后离心收集，以未浸种小球藻为对照，分别接种到实际废水中，光暗比为12∶12，其他培养条件与②相同。
1.2.2 测定项目及方法 生物量和比生长速率：生物量采用光密度法[18]进行测定。取小球藻藻液，使用紫外可见分光光度计测定样品在680 nm下的吸光度(OD值)，以此衡量小球藻在培养过程中的相对生长量。通过OD值和时间计算小球藻的比生长速率[19]。比生长速率μ= ( lnN1-lnN0)/(t1-t0)(t0为初始时刻，t1为不断增加的时间，N1与N0为对应t1和t0时刻的OD值)。
光合色素浓度或含量测定：参考Li等[14]、Pruvost等[20]的方法提取小球藻的色素并计算其浓度或含量。新鲜小球藻藻液离心后直接用于测定色素浓度(mg/L)，以真空冷冻干燥机干燥24 h后的小球藻用于测定色素含量(mg/g)。通过甲醇法提取的色素用紫外可见分光光度计测定480、652和665 nm下的OD值，利用相应的公式，分别计算总光合色素浓度及叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。
Chl-a(mg)=(-8.096×A652+16.517×A665)×n×V1
(1)
Chl-b(mg)=(27.441×A652-12.169×A665)×n×V1
(2)
E160A(mg)=4×A480×n×V1
(3)
总光合色素浓度(mg/L)=(Chl-a+Chl-b+E160A)/V
(4)
叶绿素a含量(mg/g)=Chl-a/m
(5)
叶绿素b含量(mg/g)=Chl-b/m
(6)
类胡萝卜素含量(mg/g)=E160A/m
(7)
式中，Chl-a、Chl-b和E160A分别为提取的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素量，A480、A652和A665分别为色素提取液在波长480、652和665 nm下的OD值，n为提取液稀释倍数，V1为提取液体积，V为用于提取的藻液样本体积，m为称取的干燥样品重量。
水质指标：将收集的水样11 000 r/min离心8 min后，用0.45 μm 醋酸纤维素滤膜进行过滤，滤液进行以下水质指标测定。CODcr采用重铬酸盐法(GB 11914—1989《水质—化学需氧量的测定》)进行测定，氨氮浓度采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535—2009《水质—氨氮的测定》)进行测定，总磷含量采用钼酸铵分光光度法(GB 11893—1989《水质—总磷的测定》)进行测定，色度采用分光光度法[21]进行测定，pH用SevenCompact pH计测定。
1.3 统计分析
采用Excel 2010和Origin 2019b对试验数据进行统计分析和制图，以SPSS 26.0进行单因素ANOVA检验。
2.1 沼液浸种对小球藻生长的影响
2.1.1 小球藻的生长状况 通过预实验发现，沼液浸种时间过长会导致小球藻培养过程中细胞变黄变白，在短期内死亡，因此本研究选择4、8和12 h为浸种时间，以浸种0 h为对照。从图1-A可看出，在BG11培养基中培养的前4 d，浸种时间越长的小球藻其OD值增长速度越慢，而未浸种小球藻生长最快，说明沼液浸种时间越长，对小球藻生长的抑制作用越明显；
从培养的第5天开始，浸种8 h小球藻的OD值逐渐大于浸种4和12 h小球藻的OD值，说明浸种时间长短对小球藻生长的影响存在差异。从图1-B可看出，在BG11培养基中培养的第1和第2天，浸种时间越长小球藻的比生长速率越小，浸种4和8 h小球藻的比生长速率分别在培养的第3和第4天最接近未浸种小球藻的比生长速率，而浸种12 h小球藻在培养7 d后其比生长速率才与未浸种小球藻接近，说明沼液浸种时间对受损藻细胞恢复正常生长所需时间具有不同程度影响，浸种时间越长，小球藻恢复正常生长所需时间越长。
2.1.2 微藻总色素浓度和叶绿素a/b的变化情况 对BG11培养基中小球藻总色素浓度(图2-A)和BG11培养基中小球藻生长变化曲线(图1-A)进行比较，发现浸种小球藻在生长过程中总色素浓度与OD值变化趋势相似，说明小球藻总色素浓度变化也能反映小球藻的生长状况。从图2-B可看出，在BG11培养基中培养第1天，浸种时间越长对小球藻叶绿素a的损害越大，其叶绿素a/b下降越明显；
叶绿素a/b下降后，在BG11培养基中培养的第2天，浸种4和8 h小球藻的叶绿素a/b达峰值，浸种12 h小球藻的叶绿素a/b在培养第3天时达峰值，其中，浸种4和12 h小球藻的叶绿素a/b峰值比相同时期未浸种小球藻大，说明小球藻浸种时间越长，叶绿素a/b达到峰值所需时间越长；
从在BG11培养基中培养的第4天开始，浸种0、4、8和12 h小球藻的叶绿素a/b差异较小，保持在3.57～3.89。
2.2 最佳浸种小球藻的确定
2.2.1 浸种小球藻的生长状况 由图3-A可看出，在含氨氮培养基中培养前2 d，浸种0、4、8和12 h小球藻的OD值差异不明显，但从培养的第3天开始，浸种8 h小球藻的OD值明显大于其他小球藻，培养7 d后，其OD值较未浸种小球藻提高17.3%，分别较浸种4和12 h小球藻提高10.4%和6.0%，说明沼液浸种8 h对小球藻的生长具有明显促进作用。由图3-B可知，在含氨氮培养基中培养的第1天，浸种8、4和12 h小球藻的比生长速率分别为未浸种小球藻的1.27倍、1.23倍和94%，在培养的第2天，浸种8、4和12 h小球藻的比生长速率分别是未浸种小球藻的1.19、1.15和1.09倍，其中，浸种12 h小球藻的比生长速率在培养第1天时小于未浸种小球藻，而在培养第2天时大于未浸种小球藻，说明浸种12 h的藻细胞在BG11培养基中扩培1周后未能完全修复，在含氨氮培养基中培养至第2天时才恢复正常生长；
从培养第3天开始，浸种4和12 h小球藻的比生长速率差异不明显，但均大于未浸种小球藻；
浸种8 h小球藻的比生长速率一直比其他浸种时间小球藻大，说明其生物量增长最快。综上所述，沼液浸种可促进小球藻生长，浸种8 h小球藻在含氨氮培养基中生长状况最佳。
2.2.2 氨氮的去除效果 由图4-A可知，在含氨氮培养基中培养2 d后，浸种8 h小球藻所在含氨氮培养基中的氨氮浓度一直低于其他浸种时间小球藻所在的含氨氮培养基。由图4-B可知，在含氨氮培养基中培养7 d后，浸种0、4、8和12 h小球藻对氨氮的去除率分别为46.47%、49.58%、50.85%和47.47%，其中，浸种8 h小球藻对氨氮的去除率显著高于其他浸种时间小球藻对氨氮的去除率(P<0.05，下同)。可见，浸种8 h小球藻对培养基中氨氮的去除效果最佳。
2.2.3 小球藻的色素含量 从图5可看出，各浸种时间小球藻在含氨氮培养基中培养7 d后，其叶绿素a/b在5.54～5.82，相互间差异不显著(P>0.05，下同)，说明小球藻细胞中叶绿素a/b的大小不是影响小球藻生长的关键因素；
叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量在不同浸种时间小球藻间存在差异，其中，浸种8 h小球藻的叶绿素a含量和类胡萝卜素含量与浸种0和4 h小球藻之间的叶绿素a含量和类胡萝卜素含量差异显著，浸种8 h小球藻各光合色素含量和浸种12 h小球藻间无显著差异，叶绿素b含量在不同浸种时间小球藻之间无显著差异。各浸种时间小球藻的叶绿素a含量在37.6～44.2 mg/g，类胡萝卜素含量在8.7～10.3 mg/g，其中，浸种8 h小球藻细胞的叶绿素a含量是浸种0、4和12 h小球藻的1.17、1.15和1.05倍，浸种8 h小球藻细胞的类胡萝卜素含量是浸种0、4和12 h小球藻的1.19、1.19和1.06倍，说明浸种8 h小球藻细胞的叶绿素a含量比类胡萝卜素含量更高，也高于其他浸种时间小球藻细胞的叶绿素a含量。可见，对小球藻生长具有重要影响的光合色素是叶绿素a，沼液浸种可提高小球藻细胞的叶绿素a含量。
2.3 利用最佳浸种小球藻处理实际废水的效果
2.3.1 小球藻的生长状况 浸种8 h小球藻在含氨氮培养基中的生长状况和脱氮效果最好，因此以浸种8 h小球藻为藻种开展实际废水处理试验。由图6可知，在实际废水培养基中培养1 d后，浸种8 h小球藻的OD值大于未浸种小球藻；
在培养基中培养7 d后，浸种8 h小球藻的OD值比未浸种小球藻提高26.0%，说明沼液浸种8 h可促进小球藻在实际废水培养基中生长；
浸种8 h和未浸种小球藻在实际废水培养基中的pH均保持在7.00～8.20，该pH范围较适合小球藻生长，说明pH对小球藻生长影响较小。
2.3.2 氨氮和总磷的去除效果 从图7-A可看出，浸种8 h和未浸种小球藻对废水中的总磷均有较高的去除率，从培养第3天开始，小球藻对总磷的去除率均保持在95.0%以上，说明未浸种小球藻的除磷能力已经很好，没有强化潜力。由图7-B可知，浸种8 h小球藻比未浸种小球藻具有更高的氨氮去除率，随着培养时间的延长，废水中的氨氮浓度逐渐下降，培养第7天时，浸种8 h小球藻对氨氮的去除率达95.0%，较未浸种小球藻对氨氮的去除率提高13.1%，说明沼液浸种可明显提高小球藻对氨氮的去除效果。
本研究中，在BG11培养基中培养的前4 d，沼液浸种小球藻时间越长的小球藻受到伤害越大，小球藻生长受到抑制越明显，其比生长速率越小。沼液中的氨氮可能是对小球藻产生毒害作用的主要成分，已有研究表明，当氨氮浓度超过微藻承受限值时，氨氮即可直接进入藻细胞内对微藻光合作用相关酶产生毒害作用，严重时会导致微藻细胞死亡[22-23]。本研究结果表明，高氨氮沼液直接浸种小球藻的生长曲线和总色素浓度变化曲线大体吻合，说明叶绿素浓度的变化情况能反映小球藻在培养基中的生长状况[24]；
高氨氮沼液浸种小球藻的时间越长，在BG11培养基中培养1 d后的叶绿素a/b越低，达到叶绿素a/b峰值所需时间越长，说明沼液对小球藻的光合系统产生了影响；
在BG11培养基中培养4 d后，浸种8 h小球藻表现出与前4 d不同的生长规律，其OD值逐渐超过浸种4和12 h小球藻，说明浸种8 h小球藻能修复藻细胞的损伤，达到强化小球藻的目的，而浸种4 h时间过短，对小球藻的影响较小，浸种12 h时间过长，对小球藻的损害过大。可见，氨氮进入小球藻细胞作用时间的长短对其细胞的影响强度存在差异，因此，可通过控制浸种时间来控制沼液影响小球藻的强度。
本研究中，在含氨氮培养基中浸种8 h小球藻的适应性更强，具有更高的相对生长量和氨氮去除率，同时，培养7 d后小球藻细胞中的叶绿素a和类胡萝卜素含量更高。史飞飞等[25]研究指出，在抗逆性驯化或锻炼过程中，微藻抗逆性相关基因被诱导激活表达，其细胞生理相应地发生适应性改变。Li等[14]通过实验室适应性进化得到的耐高CO2浓度和高产量藻株，其细胞中的光合色素含量相比原始藻株更高，因此推测，高氨氮沼液浸种的小球藻在含氨氮培养基中具有更好的生长状况是因为沼液浸种可促使小球藻合成色素相关基因的表达，并提高藻细胞中光合色素含量，这可进一步解释本研究中浸种8 h的受损小球藻会在增殖过程中朝着对生长更有利的方向改变，从而得到浸种8 h小球藻较其他浸种时间小球藻生长状况更佳的研究结果。Wang等[16]、韩浩[26]通过逐步提高沼液百分含量来驯化微藻，需4～5周才能达到驯化目的，这对于驯化小球藻来说既复杂且耗时，而本研究利用沼液直接浸种以强化小球藻所需时间更短，说明通过沼液直接浸种强化小球藻的方法可很好地解决小球藻强化问题。
本研究利用浸种小球藻处理实际废水以检验沼液浸种小球藻的强化效果，结果显示浸种8 h小球藻更适应在实际废水中生长，相比未浸种小球藻生长状况更佳；
浸种8 h小球藻继承了未浸种小球藻的高效除磷性，对初始总磷浓度为11.47 mg/L的实际废水进行3 d处理后的总磷去除率均在95.0%以上，与Wang等[16]的研究结果一致，而叶庆等[12]利用诱变得到的小球藻在未灭菌沼液中培养11 d对总磷浓度为12.21 mg/L的磷去除率仅为62.7%，王忠江等[18]利用未驯化小球藻在含20%沼液和BG11培养基的混合液中培养12 d，使其总磷浓度从14.0 mg/L下降至5.0 mg/L以下需6 d，培养结束时总磷去除率仅为92.0%，说明本研究的强化小球藻具有很好的除磷效果；
微藻在废水(pH 7.00～8.20)中生长速率较快[27]，对氨氮去除的主要方式为吹脱分子态氨氮和生物吸收离子态氨氮，而实际废水中主要存在离子态氨氮[28]。因此，本研究浸种8 h小球藻更高的相对生长量可促进小球藻对氨氮的吸收同化。
利用高氨氮沼液浸种小球藻、通过控制浸种时间来强化小球藻处理沼液效果的方法可行。其中，以高氨氮沼液直接浸种小球藻8 h对小球藻的强化效果最佳，可提高小球藻细胞的叶绿素a含量，促进小球藻生长并收获更多的生物量；
浸种8 h小球藻更适应在废水中生长，对污染物的去除效率得到提高，可在实际废水处理中推广应用。