张丽珍, 赵立华, 吴 阔, 陈永对, 苏晓霞, 张仲凯, 董家红
(1. 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 云南省农业生物技术重点实验室, 农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室, 昆明 650205; 2. 云南中医药大学中药学院暨云南省南药可持续利用重点实验室, 昆明 650500)
马铃薯是世界上继水稻、玉米、小麦后的第四大主粮作物。我国马铃薯年种植面积稳定在500万hm2以上,在保障粮食安全、助力脱贫攻坚中起到重要作用。马铃薯的种薯繁殖主要靠无性繁殖,极易感染病毒,由于病毒在马铃薯体内的积累,造成马铃薯种性退化,品质与产量降低。能侵染马铃薯属的病毒有40余种,病毒病害是马铃薯产业的重要危害[1-3]。近年的研究数据显示,马铃薯S病毒(potato virus S, PVS)、马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY)是我国马铃薯试管苗和种薯上检出率最高的2种病毒,检出率近20%,高于其他病毒的检出率[4-5]。有效控制马铃薯病毒病的主要方法是通过茎尖脱毒,然而传统的茎尖脱毒,较难脱除PVS、PVY等[6]。使用抗病毒化合物病毒唑(ribavirin)干扰病毒复制,联合茎尖脱毒可成功脱除马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)、马铃薯M病毒(potato virus M, PVM)、PVY和PVS,获得健康马铃薯植株[7-11]。由于植物种类、品种、感染病毒种类的不同,病毒唑会对植物产生不同程度的毒性,即使在5 μg/mL的浓度条件下,植株的生长也会受到严重影响[8],在0～150 mg/L浓度范围,马铃薯试管苗株高和鲜重会随着病毒唑的浓度增加而降低[12]。
3-丙酮基-3-羟基羟吲哚(3-acetonyl-3-hydroxyoxindole, AHO)是从板蓝Strobilanthescusia中分离得到的一种天然产物,对菊科白粉菌Erysiphecichoracearum、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt tospovirus)有较好的抑制效果[13-15],作用机制研究表明,AHO作用于植物水杨酸途径介导的防御反应而激活植物的系统获得抗性[13,16],以抵抗病原菌的侵染。AHO属于植物源的抗性诱导剂,能诱导植物产生抗性,抑制病毒在植物体内的复制、运动,且不影响植物正常生长。
本研究在继代培养前的马铃薯茎尖组织培养小苗上喷施100 mg/L AHO水剂,经过3次处理后,能快速有效地获得无病毒健康马铃薯再生苗,为生产马铃薯无病毒种苗提供了有效措施。
1.1 植物材料、诱抗剂及质粒
带病毒马铃薯材料为‘定薯3号’ ‘定薯4号’ ‘靖薯3号’ ‘靖薯4号’的薯块,经ELISA、负染色电镜观察方法检测,确定‘定薯3号’和‘定薯4号’的薯块携带PVS,‘靖薯3号’和‘靖薯4号’的薯块携带PVY。
AHO干粉由中国科学院昆明植物所郝小江实验室提供,取1 g AHO干粉先溶于1 mL二甲基亚砜,然后用ddH2O定容至100 mL,获得1%的AHO水剂(浓度为10 g/L)作为储存液,用细菌过滤器过滤后保存备用。使用时取储存液用ddH2O稀释100倍(浓度为100 mg/L)。
用于构建PVS、PVY荧光定量检测方法标准曲线的重组质粒为本实验室自制。
1.2 马铃薯茎尖剥离、茎尖组织培养、扩繁
马铃薯薯块用10～20 mg/L赤霉素溶液浸种15～30 min,晾干后催芽至芽长1～2 cm。取健壮芽,流水冲洗30 min,无菌条件下用75%乙醇浸泡30 s,无菌水冲洗2次;再用0.1%升汞浸泡6 min,无菌水漂洗5～8次,消毒的外植体接种在MS培养基上[17],培养获得马铃薯植株。剪取该马铃薯植株的茎尖,借助40倍双目解剖镜,剥离茎尖直至露出半圆形光滑的生长点,用锋利的无菌解剖针小心切取0.2 mm以下的带1～2个叶原基的茎尖,迅速接种于已准备好的茎尖培养基(MS+0.6 mg/mL 6-BA+0.3 mg/mL GA+0.1 mg/mL NAA)上,于温度20～25℃,光照2 000～3 000 lx,每天光照12 h条件下培养,直至长成带4～5个叶片的完整马铃薯试管苗。每个试管苗植株可剪成4～5段扩繁,每隔一节带一片叶,切段直立地插入培养基中培养。
1.3 AHO处理试管苗
培养11 d 后,分别取带有PVS的‘定薯3号’和‘定薯4号’以及带有PVY的‘靖薯3号’和‘靖薯4号’的试管苗,各24株(平均株高5 cm左右),喷施100 mg/L AHO水剂,以喷施不含AHO(其他条件相同)的溶液为对照,每隔2 d喷施1次,共喷施3次,再培养2 d后取试管苗测株高、根长和鲜重;剥离茎尖置于茎尖培养基培养长至4～5个叶片,用负染色电镜观察、ELISA以及荧光定量PCR检测。
试验数据使用 Excel 2007、 SPSS 23.0 软件进行统计分析。
1.4 负染色方法
马铃薯芽眼部分或者组培苗负染参考文献[18]。取0.5 g病叶置于20 μL的2.5%戊二醛上切碎,将铜网置于浸出液表面吸附3 min,吸干铜网表面液体后置于1%的钼氨酸(m/V,溶于pH 7.2 的0.2 mol/L磷酸缓冲液)染色2 min。在透射电镜(FEI TECNAI G2,USA)下观察。
1.5 ELISA
采用ELISA对‘定薯3号’ ‘定薯4号’ ‘靖薯3号’ ‘靖薯4号’中的病毒进行检测。所检病毒包括PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、TSWV、TZSV和 PVM。TZSV为本实验室自制抗体,其余病毒的检测试剂盒购自美国Agdia公司,按照说明书进行检测。阳性样品为本实验室保存,阴性样品为健康马铃薯试管苗。
1.6 荧光定量RT-PCR
用于荧光定量RT-PCR检测的引物采用Primer 5设计,引物序列见表1。用购自Ambion公司的TRIzol试剂提取样品总RNA。用北京全式金公司One-Step gDNA Removal 反转录试剂盒合成cDNA第一链,用FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)制备反应体系,包括cDNA 1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2.5 μL,Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)10 μL, ddH2O 4 μL。反应在Applied Biosystems StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)荧光定量PCR仪上进行,反应程序为:95℃ 10 min;95℃ 10 s,57℃ 30 s,72℃ 30 s,40个循环。每个反应5个重复。
标准曲线:用Nano Drop 2000 测定重组质粒的PVS浓度为141.70 ng/μL,OD260/OD280为1.83;PVY浓度为135.25 ng/μL,OD260/OD280为1.84。对重组质粒进行10倍连续梯度稀释,作为病毒检测用阳性标准品,用于构建标准曲线。
表1 PVS和PVY的检测引物
2.1 负染色电镜及ELISA检测种薯芽带毒种类
在‘定薯3号’ ‘定薯4号’ ‘靖薯3号’ ‘靖薯4号’的薯块新芽汁液中,用电镜均观察到线状病毒粒子(图1),未发现其他病毒粒子。ELISA检测结果表明‘定薯3号’和‘定薯4号’的样品中带有PVS,‘靖薯3号’和‘靖薯4号’中带有PVY,没有检测到其他病毒。
图1 电镜观察到的病毒粒子Fig.1 Virus particles under the electron microscope
2.2 AHO处理
2.2.1AHO处理对马铃薯试管苗生长的影响
携带PVS的‘定薯3号’和‘定薯4号’以及携带PVY的‘靖薯3号’和‘靖薯4号’的试管苗,喷施3次100 mg/L的AHO后2 d(扩繁后的第20天)取试管苗测量株高(cm)、根长(cm)和鲜重(g)。由图2可见,喷施100 mg/L AHO的4个品种株高、根长和鲜重较对照略有增加,无不良影响。
图2 AHO对马铃薯试管苗生长的影响Fig.2 Effect of AHO on the growth of in vitro potato plantlets
2.2.2ELISA和电镜检测AHO处理后的试管苗
每个品种各挑选24株试管苗,分别用100 mg/L AHO喷施,对照不含AHO(其他条件相同),每隔2 d喷施1次,共3次,末次喷施2 d后取试管苗再进行茎尖剥离脱毒,培养30 d后,取存活试管苗用ELISA检测PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、TSWV、TZSV和 PVM等病毒,各品种均未检测到PVX、PLRV、PVA、TSWV、TZSV和 PVM,在‘定薯3号’和‘定薯4号’检测到PVS,在‘靖薯3号’和‘靖薯4号’检测到PVY,与用于脱毒的薯块检测结果一致,但AHO处理的试管苗阴性率要高于对照(表2)。
进一步计算ELISA检测的OD值平均值发现,处理前、对照、AHO处理的试管苗,PVS、PVY的ELISA检测OD值平均值呈递减趋势(图3)。
表2 马铃薯试管苗存活率及病毒脱除率1)
图3 处理前、对照、AHO处理的马铃薯试管苗ELISA检测Fig.3 ELISA detection for in vitro potato plantlets of pre-treatment, control and AHO-treatment
抽取每个处理ELISA检测值最低的试管苗进行负染色电镜观察验证,结果见表3、4,电镜观察显示处理前、对照、AHO处理的试管苗中的病毒粒子数量也呈下降趋势。
表3 ‘定薯3号’和‘定薯4号’试管苗处理前、对照、AHO处理ELISA和电镜负染色检测1)
续表3 Table 3(Continued)
表4 ‘靖薯3号’和‘靖薯4号’试管苗处理前、对照、AHO处理ELISA、电镜负染色检测
2.2.3荧光定量RT-PCR检测病毒相对量
为证实AHO对病毒的抑制作用,用荧光定量RT-PCR对分别喷施1、2、3次AHO的马铃薯试管苗进行病毒相对量检测,检测结果见图4。抑制率由病毒相对浓度计算而得,计算公式:抑制率=(1-喷施AHO/不喷施AHO)×100%。由图4可知,AHO对‘定薯3号’‘定薯4号’和‘靖薯3号’‘靖薯4号’试管苗中的PVS和PVY具有显著的抑制效果,喷施3次后,抑制率可达99.97%以上。
图4 AHO处理后马铃薯试管苗中病毒相对量Fig.4 Virus relative concentration of in vitro plantlets
马铃薯大田种薯和试管苗样品中PVS、PVY的检测率较高[4-5],可能与这两种病毒较难通过茎尖培养脱除有关。AHO能诱导植物产生系统性抗性,本研究用100 mg/L AHO喷施携带PVS的‘定薯3号’‘定薯4号’和携带PVY的‘靖薯3号’‘靖薯4号’的试管苗,茎尖剥离培养后,发现用AHO处理与对照的苗存活率均在50%,株高、根长、鲜重无显著差异(图2),说明AHO对‘定薯3号’ ‘定薯4号’‘靖薯3号’‘靖薯4号’的试管苗无毒性;病毒检测发现,携带PVS的‘定薯3号’和‘定薯4号’试管苗用AHO处理后PVS阴性率为19.80%,未处理的试管苗PVS阴性率为4.17%;用AHO处理的‘靖薯3号’和‘靖薯4号’试管苗PVY阴性率为11.85%,未处理的为3.84%。ELISA检测显示,带毒试管苗检测到病毒OD值,相对未处理呈下降趋势(图3)。负染色电镜观察显示,用AHO处理,带毒试管苗平均每30个视野观察的病毒粒子低于未处理(表3、4)。荧光定量RT-PCR检测了未处理、处理1次、2次、3次后(第3次的取ELISA检测为阴性的试管苗),对PVS、PVY具有显著的抑制效果(图4),抑制率高于99.97%。通常马铃薯病毒的脱除效率依据病毒种类、病毒量等特性,往往需要茎尖剥离3次以上,才能普遍获得无毒(或检测不到病毒)的试管苗,我们的研究结果表明,使用AHO处理后,提高了病毒的脱除效率。茎尖分生组织培养技术是获得马铃薯无病毒苗非常有效的方法,但脱毒效率往往会受到茎尖分生组织大小、病毒特性、品种的影响,在分生组织培养前,通过热处理、冷冻处理、病毒唑或几种方法联合可以提高脱除病毒的效率[11],但因病毒唑的植物毒性,会降低茎尖分生组织存活率[19-20]。本文使用的AHO除对植物有较好的诱抗作用外,与对照比较并没有植物毒性,为有效脱除马铃薯病毒提供了一个可选的方法。
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