刘雪婷，孙小慧，朱建敏*，李林，李文悦
(1.山东中医药大学 a.中医学院;b.第一临床医学院,山东 济南 250013；
2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014)
据国际癌症研究机构统计，2020年女性乳腺癌已超过肺癌成为最常见的癌症，新增病例约230万例，占所有癌症的11.7%[1]。目前治疗方式以手术为主，根据分期和激素受体状态，可能包括化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗[2]，这些治疗在显著提高生存率的同时也会产生长期的生理和心理后遗症，严重影响生活质量。随着中国传统医学的发展，中医药治疗成为乳腺癌综合治疗的重要部分，具有扶正抗癌、调节体质、缓解因化疗引起的不良反应、提高患者生活质量等作用。
乳腺癌属于中国传统医学 “乳岩”“石痈”“奶岩”的范畴，气滞血瘀贯穿乳岩发生发展的始末，气为血之帅，血随气行，若肝气不舒，则血行不畅，日久形成癥瘕积聚，治法当行气活血化瘀[3]。中医认为乳岩发生发展的重要病机之一为瘀血内阻[4]，三棱-莪术是临床上常用的活血化瘀药对,三棱更善长破血，莪术行气之力更强。现代研究表明，二者的共同抗癌机制是诱导肿瘤细胞凋亡、干扰肿瘤细胞周期、抗血管内皮生成、调控肿瘤微环境[5]。
莪术味辛、苦，性温，归肝、脾二经，首载于《药性论》，有破气行血、消积止痛之功，三棱性味及所治病证与莪术相似，始载于《本草拾遗》。现代植物化学研究表明，莪术的活性成分主要有姜黄素类、挥发油、莪术醇、多糖类[6]，姜黄素类发挥活血化瘀作用[7]，莪术油是莪术发挥抗肿瘤功效的主要成分，可用于乳腺癌的防治[8]。三棱总黄酮亦可抗肿瘤、抗栓。尽管三棱-莪术药对抗乳腺癌疗效在临床中得到证实，但其具体的作用机制仍未明确。网络药理学将生物学、药理学与传统中药相结合，构建有效活性成分-疾病-靶点-通路途径网络，与中医学整体观与辨证论治不谋而合[9]。因此，本研究运用网络药理学探究三棱-莪术药对抗乳腺癌的有效活性成分及作用机制，为今后开展其临床研究与应用提供理论参考。
1.1 药物有效成分及作用靶点收集
运用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP)获取三棱、莪术的活性成分，以口服生物利用度(oralbio-availability， OB)≥30%和类药性(drug-likeness ，DL)≥0.18为标准，最终确定三棱、莪术有效活性成分。通过TCMSP数据库查询其有效活性成分相对应的靶蛋白，并利用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)，物种选择为Homo sapiens，剔除非人类、重复及不规范的靶点，将靶基因进行基因符号Gene Symbol标准化命名。
1.2 疾病相关靶点筛选
将“breast cancer”分别输入GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(http://www.omim.org/)进行检索，将两个数据库的筛选结果合并删除重复项后获得乳腺癌相关靶点，运用维恩图将药物靶点和乳腺癌的治疗靶点取交集，获得三棱-莪术药对抗乳腺癌的靶点。
1.3 成分-疾病-靶点网络构建
以药物、有效活性成分、疾病、交集靶点为节点，通过Excel表格构建相应关系，导入到Cytoscape 3.7.2软件中绘制中药-成分-疾病-靶点网络图，运用Cytoscape 3.7.2软件中的Network Analyzer插件进行拓扑分析，计算节点的度值(degree)、介度中心性(betweenness centrality, BC)和紧密中心性(closeness centrality，CC),设置阈值为BC值中位数和CC值中位数，按度值大小排序筛选关键活性成分。
1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建
将三棱-莪术抗乳腺癌的潜在作用靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org/)，将所得数据以TSV格式导出到Excel表格中再导入Cytoscape 3.7.2软件中构建靶点蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein intrraction，PPI)网络图，使用Cytoscape中MCODE插件进行分析筛选出前10个蛋白，作为三棱-莪术抗乳腺癌的核心靶点。
1.5 GO功能富集与KEGG通路分析
将交集靶点导入DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，运用DAVID数据库进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析与京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。设置阈值P<0.01，排除非特异性GO功能及KEGG通路，依据P值大小筛选出与乳腺癌关联度较大的条目，绘制气泡图。Cytoscape 3.7.2软件中构建成分-靶点-通路网络，综合预测三棱-莪术与乳腺癌的生物学特性及调控通路。
1.6 分子对接验证
选取PPI网络中排名前3的关键靶点，与三棱-莪术药对有效活性成分进行分子对接。从Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载小分子配体的2D结构，使用chem3D软件完成优化力学结构，在AutoDockTools中操作，检测配体的root、选择配体可旋转的键，并导出pdbqt格式文件。从RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取靶点的最佳三维晶体结构文件，保存为pdb格式。经Pymol软件进行去水、加氢后，利用AutoDock软件计算电荷、添加原子类型，转换为pdbqt格式，利用AutoDock Vina软件计算靶点与活性成分之间的最低结合能并将分子对接验证结果可视化。
2.1 三棱-莪术有效成分及作用靶点
通过TCMSP数据库，以OB≥30%，DL≥0.18作为筛选参数，初步得到8个活性成分。莪术有3个，三棱有5个，其中常春藤皂苷元(MOL000296)为二者共有成分，删除重复数据后剩余活性成分7个。结合Unitprot数据库确认并转换，最终共得到73个药效靶点。
2.2 乳腺癌靶点筛选
通过GeneCards、OMIM数据库检索合并去重后得到3 629个乳腺癌相关靶点。运用venny平台将三棱-莪术药效靶点与乳腺癌的治疗靶点取交集，得到三棱-莪术药对抗乳腺癌的靶点43个，如图1所示。
图1 药物靶点和疾病靶点维恩图Fig.1 Venn diagram of the drug targets and disease targets
2.3 药物-成分-疾病-靶点网络构建
利用Cytoscape 3.7.2构建三棱-莪术的药物-成分-疾病-靶点网络，如图2所示。该网络共含有53个节点和118条边，涉及7种活性成分和43个潜在靶点，以不同的颜色或形状来表示。按度值排序，得到芒柄花黄素、β-谷甾醇、豆甾醇这3个成分可能是三棱-莪术抗乳腺癌的关键成分，从图中可以看出同一成分对应多个靶点和多个成分对应同一靶点的关系，体现了三棱-莪术多成分、多靶点抗乳腺癌的作用特点。
注：黄色菱形节点代表疾病；
蓝色椭圆形节点代表药物；
粉色矩形节点代表成分；
绿色椭圆形节点代表靶点。图2 药物-成分-疾病-靶点网络图Fig.2 The drug-ingredient-disease-target network map
2.4 PPI网络构建及PPI网络构建及核心靶点的筛选
利用Cytoscape 3.7.2绘制PPI网络图，共涉及41个节点，195条边，如图3所示。
注：图中节点表示蛋白，度值用节点大小与颜色表示，边表示功能相关性，边的粗细反映作用强度(combine score)。图3 PPI网络图Fig.3 Network diagram of PPI
使用Cytoscape中MCODE插件进行分析，筛选出排名前10的关键蛋白，分别是JUN、CASP3、PTGS2、ESR1、MPK14、PPARG、SIRT1、NOS3、TGFB1、NOS2，如图4所示，这10个蛋白在整个网络中起着关键作用，由此可见，JUN、CASP3、PTGS2为三棱-莪术抗乳腺癌的核心靶点。
注：颜色由浅黄到深红，颜色越深，表示蛋白的作用越强。图4 PPI网络关键节点Fig.4 The key nodes of the PPI network
2.5 GO和KEGG富集分析结果
通过DAVID 6.8数据库对43个潜在靶点进行GO和KEGG分析，共获得303条GO条目，包括214个生物过程、63个分子功能、26个细胞组分。如表1所示，生物过程主要是对雌二醇的反应、对药物的反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录DNA模板正调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子起始转录、类固醇激素介导的信号通路、转录的正调控等；
表2所示，分子功能主要是类固醇激素受体、酶结合、蛋白质结合、类固醇结合等；
表3所示，细胞组分主要是膜筏、细胞质、核、核质、核染色质、线粒体、线粒体外膜等。KEGG富集通路如图5所示，主要是VEGF信号通路、TNF信号通路、p53信号通路、催乳素信号通路、P13K-Akt信号通路、AMPK信号通路等。利用Cytoscape 3.7.2软件绘制成分-靶点-通路网络图，见OSID附图1。
表1 三棱-莪术治疗乳腺癌涉及的主要生物过程(前10位)
表2 三棱-莪术治疗乳腺癌涉及的主要分子功能(前10位)
表3 三棱-莪术治疗乳腺癌涉及的主要细胞组分(前10位)
表3(续)
注: P值大小与颜色有关，颜色越红，代表P值越小，可信度越高；
富集条目数量与节点大小有关，节点越大，代表富集条目数量越多。图5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis
2.6 分子对接结果
PPI网络中排名前3的关键靶点JUN、CASP3、PTGS2与三棱-莪术药对有效活性成分常春藤皂苷元、β-谷甾醇、芒柄花黄素、豆甾醇、反式软骨酸进行分子对接验证，结果如表4所示。
表4 有效活性成分与核心靶点的分子对接结果
表4(续)
分子对接的分值用于评估药物活性成分与核心靶点之间的结合活性，结合能<-4.25 kJ/mol表示小分子配体与蛋白受体之间有结合活性；
结合能<-5.0 kJ/mol表明两者之间有较好的结合活性；
结合能<-7.0 kJ/mol则说明二者之间有很强烈的结合能力[10]。根据分子对接结合能最低值筛选出结合能力最优的前四组蛋白，即PTGS2与常春藤皂苷元、β-谷甾醇、芒柄花黄素、豆甾醇结合性最好，如图6所示，常春藤皂苷元通过HIS-356、LYS-97、ASN-581、SER-579氨基酸残基形成四条氢键，β-谷甾醇通过LYS-532、GLN-372氨基酸残基形成两条氢键，芒柄花黄素通过GLN-461、ASN-39氨基酸残基形成两条氢键，豆甾醇通过ARG-333形成一条氢键，均与PTGS2紧密结合。
图6 有效活性成分与核心靶点蛋白的分子对接图Fig.6 Molecular docking diagram of the effective active ingredients and core target proteins
药物-成分-疾病-靶点网络图显示，三棱-莪术药对的核心活性成分包括常春藤皂苷元、芒柄花黄素、β-谷甾醇、豆甾醇、反式软骨酸。常春藤皂苷元(MOL000296)为二者共同成分，通过调节线粒体凋亡途径诱导乳腺癌细胞凋亡，降低线粒体APAF-1和细胞色素C蛋白，上调caspase-3和caspase-9的活性[11]。β-谷甾醇可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制PI3K-Akt信号通路，可用于治疗乳腺癌、前列腺癌和冠状动脉疾病[12]。豆甾醇与化疗药物协同抑制乳腺癌的增殖和转移，有广泛的抗癌作用[13]。芒柄花黄素通过抑制纤维细胞生长因子2(FGF2)的活性抑制肿瘤血管内皮生成，抑制乳腺癌细胞中CXCR4和HIF-1α的过度表达，抑制乳腺癌细胞的增殖并阻断致癌信号通路[14]。贾绍华等[15]研究表明，芒柄花素通过激活JNK信号通路诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡抑制乳腺癌细胞增殖。
通过PPI网络图可见JUN、CASP3、PTGS2、ESR1、MPK14等是三棱-莪术抗乳腺癌的关键靶点。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联是一种复杂的信号通路，对于将细胞外刺激转化为广泛的细胞过程至关重要。c-Jun N-末端激酶(JNK)通路是参与细胞活动调节的三种具有良好特征的MAPK通路之一，调节细胞周期、细胞增殖和转化生长[16]。Caspase家族是肿瘤细胞凋亡的起始者和执行者，首先Caspase起始因子被凋亡信号激活，接着下游的Caspase效应因子激活， Caspase-3被激活后通过破坏细胞的蛋白结构和功能水解细胞一系列底物，在细胞凋亡中起着重要作用，成为肿瘤治疗的主要靶点[17]。PTGS2是血管生成环境的重要调节因子，通过提高血管内皮生长因子(VEGF)的表达来刺激肿瘤血管生成。近年来，PTGS2与癌症之间的潜在关系已成为抗癌研究的热点，并且已经证明PTGS2可能在肿瘤促进，特别是乳腺癌中发挥重要作用。PTGS2的高表达可促进肿瘤细胞增殖、血管生成、侵袭性、转移，以及抑制凋亡和免疫监测[18]。雌激素受体-1(ESR1)基因编码雌激素受体-α(ERα)，在70%的乳腺癌中表达，ERα表达可通过影响雌激素代谢途径调节乳腺癌风险，ESR1突变是ER阳性乳腺癌内分泌治疗抵抗和转移的原因，并对芳香化酶抑制剂产生耐药性[19-21]。MAPK14编码p38 MAPK的α亚单位，调节多种细胞因子的产生，MAPK14通过与TGF-β13的协同作用在乳腺癌细胞中诱导细胞迁移和上皮-间充质转化(EMT)中起着至关重要的作用[22]。
GO富集分析结果显示，三棱-莪术抗乳腺癌的关键靶点主要通过影响类固醇激素受体活性、转录因子活性、核激素受体结合等分子功能起作用。KEGG通路富集分析结果显示核心通路有VEGF信号通路、TNF信号通路、p53信号通路、催乳素信号通路等，揭示三棱-莪术药对可能是通过以上途径调控乳腺癌的病理进程。血管内皮生长因子(VEGF)信号通路是血管生成的关键介质，对肿瘤的发生和转移至关重要[23]。VEGF及其受体VEGFR1和VEGFR2通常在肿瘤中过度表达[24]。VEGFR2已被证明可调节血管内皮细胞增殖和迁移以及血管通透性。这些效应是通过各种信号通路的下游激活介导的，包括PI3K通路、MAPK细胞外信号调节激酶(ERK)通路等[25]。乳腺癌常伴有炎症过程，产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，TNF-α属于TNF超家族，由19种蛋白质组成，具有激活、分化、存活和细胞死亡等多种生物学功能。microRNA (miRNA)是一类重要的内源性非编码小RNA(21-25个核苷酸长)，可在转录后调节基因表达，特别是miRNA-23b和miRNA-27b与人类乳腺癌的预后不良相关，TNF-α通过AKT/NF-κB信号通路刺激两种miRNA的表达[26]。TNF-α在激活其受体后通过一个复杂的调节网络，可诱导癌细胞凋亡或坏死、细胞生长、侵袭或增殖，即TNF-α受体1和2(TNFR1/2)，以激活NF-κB信号传导途径，亦可激活JNK、MAPKs、AKT信号通路[27]。p53是第一个被发现的肿瘤抑制基因,通过转录调控下游靶基因的表达，具有消除和抑制细胞增殖、防止异常细胞的生长的功能，从而影响肿瘤的发展[28]。催乳素(PRL)是一种蛋白质激素，由垂体前叶腺嗜酸细胞分泌，研究表明乳腺癌患者体内的血清催乳素水平会明显升高，催乳素可以提高乳腺组织对致癌因素的敏感性[29]。PRL与PRLr结合可增加乳腺癌细胞(BCC)侵袭和恶性淋巴细胞增殖，并导致化疗耐药[30]。
本研究通过网络药理学分析预测了三棱-莪术药对抗乳腺癌的有效活性成分、关键靶点及作用机制，阐明了三棱-莪术药对通过常春藤皂苷元、芒柄花黄素、β-谷甾醇、豆甾醇等7个有效活性成分，作用于JUN、CASP3、PTGS2等核心靶点，干预VEGF、TNF、p53、催乳素等信号通路，影响类固醇激素受体活性、转录因子活性、核激素受体结合，从而调控乳腺癌的病理进程。分子对接技术提示该药对的有效活性成分与乳腺癌的疾病靶点可产生较好的结合活性，其中PTGS2与常春藤皂苷元、芒柄花黄素、β-谷甾醇、豆甾醇之间的结合活性可能为三棱-莪术药对抗乳腺癌的重要机制之一。三棱-莪术药对可以通过多成分、多靶点、多通路的方式抗乳腺癌的病理进程，该研究能够为乳腺癌的临床防治提供一定的理论依据。
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