李诗瑶，彭青枝，王鸣秋，刘艳 ,董婉婷
（1.湖北省食品质量安全监督检验研究院，国家市场监管重点实验室(动物源性食品中重点化学危害物检测技术)，湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北武汉 430075）（2.武汉软件工程职业学院,湖北武汉 430205）
食源性病原菌是指可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌，其入侵宿主并具有致病性。常见的食源性致病菌有金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、结核菌等[1]。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）提供的数据，全世界每年有近200 万人死于食源性病原体引起的肠道疾病[2]。现阶段，食源性致病菌的主要检测方法有培养法、生化鉴定及聚合酶链式反应法等[3-5]，其中培养法是黄金标准方法[1]，需要进行增菌、分离、鉴定等多个步骤,耗时长，具有一定的局限性。即使经过选择性增菌培养后，致病菌的快速检测仍然受到培养基成分、食品成分等影响[6-9]。因此,选择合适的分离富集方法使低浓度靶细菌能从食品基质中分离出来且减少食品成分对检测方法的干扰,对实现靶细菌快速、灵敏的检测显得尤为重要。
磁性纳米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）因其比表面积大，具有良好的生物相容性且具有超顺磁性等特点，为在食品基质中快速吸附分离致病菌提供了一种解决方案[10-12]。氨基化磁珠（N-MNPS）是在Fe3O4MNPs 表面修饰了大量氨基，在pH 值为5～9的条件下，其表面电荷为正电荷，与裸磁珠相比带正电荷的纳米粒子与细菌间的相互作用更强，更容易吸附细菌[13]。本研究基于表面带正电荷的（N-MNPS）与表面带负电荷的细菌间的静电相互作用，无需在MNPs 表面修饰特异性识别元件，省去了复杂的生物偶联步骤,减少了制备成本；
因为对细菌不具有特异性，因此能对几乎所有带负电细菌都有吸附捕获作用，当食源性疾病爆发时，可用N-MNPS 富集样品中所有类型的病原菌实现非把向检测，可以避免漏检导致的阴性结论，下游可结合多重检测手段，实现对多种食源性致病菌同步检测，提高检测效率[14]。本研究通过一系列优化确定了氨基化磁珠的最佳吸附条件，并初步验证了在模拟添加食品样品中其对常见食源性病原菌的吸附效果，为下游多重检测奠定了基础。
1.1 原料
1.1.1 实验菌种
鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115、大肠埃希氏菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7），均购自美国菌种保藏中心。
1.1.2 主要试剂
脑心浸液（Brain Heart Infusion，BHI）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐平板（Xylose Lysine Deoxycholate，XLD）、Baird-Parker（Baird-parker agar，BP）琼脂培养基、单增李斯特氏菌显色培养基（Listera Chromogenic Medium，LC）、大肠埃希氏菌O157 显色培养基、磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline，PBS），均购自北京陆桥；
氨基化磁珠（NH2-magnetic Nanoparticles，N-MNTPs），粒径分别为1 μm、300 nm、100 nm，均购自海狸生物；
其他分析试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
BSC-1600Ⅱ A2二级生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司；
Heratherm IGS400 生化培养箱，美国Thermo Fisher Scientific Inc；
ZQTY-70F 台式全温振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；
SX-700 压力蒸汽灭菌器，日本TOMY 公司；
ST40R 离心机，美国Thermo Fisher Scientific Inc；
wi114629 麦氏比浊仪，梅里埃中国有限公司；
磁力架，上海奥润微纳新材料科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种培养及制备
用接种环分别从培养基斜面（保存在4 ℃的冰箱）挑取实验菌株Salmonella typhimurium、Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes、Escherichia.coliO157:H7 至BHI 溶液中，随后于振荡培养箱36 ℃，120 r/min 培养24 h，将培养得到的菌液5000 r/min 离心10 min，然后将离心后的沉淀菌体用10 mmol/L、pH 值7.4 的无菌PBS 缓冲液洗涤三次，离心收集菌体，重悬于5 mL PBS 缓冲液中。通过麦氏比浊仪制备102～108CFU/mL 的菌液。
1.3.2 不同pH 缓冲液中N-MNPS 以及病原菌zeta 电位测定
细菌的表面电位遵循大岛软粒子理论，其表面电位取决于细菌电荷密度和膜结构[15]。根据四种细菌的最适生长pH范围，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH将10 mmol/L PBS 分别调节至pH 值：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。通过测定不同pH 值细菌菌悬液以及三种粒径（100 nm、300 nm、1 μm）N-MNPS 的zeta电位值来对细菌与N-MNPS 静电结合进行评估。
1.3.3 N-MNPS的用量对四种病原菌捕获率的影响
分别取不同量的N-MNPS（1 mg/mL）5、10、20、30、50、75、100、125、150、175、200 μg 于2 mL离心管中，磁分离后弃上清，分别加入1 mL 103CFU/mL 四种菌的新鲜菌液，在振荡培养箱36 ℃，120 r/min下温育60 min，混合均匀后磁分离N-MNPS，吸取上清液0.1 mL 分别涂布于XLD、BP、LC、大肠杆菌O157 显色平板上，同时将未使用N-MNPS 捕获的菌液同步温育，作为初始加入的总菌量，每组实验设置3 个平行，培养结束后，进行捕获率的计算。
捕获率计算公式：
式中：
X——捕获率，%；
D——上清液中的菌落数，CFU；
D0——未磁捕获的总菌落数，CFU。
1.3.4 N-MNPS 的吸附时间对四种病原菌捕获率的影响
于2 mL 离心管中，分别加入1 mL 103CFU/mL四种菌的新鲜菌液，添加由1.3.3 计算出捕获率最高的N-MNTPs 添加量，孵育5、10、20、30、45、60、90 min 后，磁吸取上清，同时将未使用N-MNPS 捕获的菌液同步温育，依照1.3.3 的温育条件及公式进行捕获率的计算。
1.3.5 单菌正交实验
根据四种病原菌的单因素实验结果，选用L9（33）正交表，以磁珠粒径，磁珠用量，吸附时间为考察因素，进行3 因素3 水平的正交实验，选取1.5 mL 浓度为103CFU/mL 的各菌液进一步优化捕获的条件。因素水平表如表1 所示。
表1 单菌正交实验因素水平表Table 1 Levels and factors to orthogonal test in individual bacteria
1.3.6 混菌单因素实验
依据1.3.5 单菌正交试验的结果设计混菌单因素实验，选出最适宜在该条件下混合的目标菌，设计条件尽量覆盖所有目标菌。分别吸取0.5 mL 103CFU/mL各菌液至2 mL 离心管充分混匀，单因素磁珠添加量为10、25、50、75、100、150、175、200 μg 孵育60 min，使用最优添加量，单因素孵育时间5、10、20、30、45、60、90 min，依照1.3.3 的温育条件及公式进行捕获率的计算。
1.3.7 大体积中N-MNTPs 对混菌的捕获效率
根据1.3.6 的小体系中最优实验结果，设计在10、50 mL 的PBS 中，平均添加三种菌液使混合菌液浓度至103、102CFU/mL，计数结果依照1.3.3 的温育条件及公式进行捕获率的计算。
1.3.8 实际样品中N-MNTPs 的捕获效率
取牛奶、水果沙拉各5 份，匀浆后分装为5 g 每份，向100 mL 锥形瓶中分别加入5 g 样品和45 mL PBS，于121 ℃灭菌15 min 后冷却至室温，加入目标病原菌菌液，使得样品中病原菌混菌终浓度为 1 02～106CFU/mL（g）。以1.3.6 的最优结果进行试验，依照1.3.3 的温育条件及公式进行捕获率的计算。
1.3.9 统计与分析
本文中所有捕获率实验平行三次。运用SPSS Statistics 26 软件统计，对数据进行显著性差异分析（p＜0.05）。
2.1 N-MNTPs 以及各病原菌在不同pH 缓冲体系中的带电荷数
Zeta 电位可以监测出不同缓冲体系中细菌表面的带电荷数、N-MNTPs 表面的带电荷数。不同pH 值条件下各细菌的Zeta 电位值结果见图1。金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌在pH 值4～11 之间Zeta电势值均低于-40 mV，沙门氏菌在pH 值6～11 之间低于-10 mV，大肠杆菌O157:H7 在pH 值5～11 之间电势低于-5 mV。由图2 可以看出N-MNPS 在pH 值2～7之间处于20 mV，在pH 值8～11 时电势值下降在pH值9～11 电势值为负值。由此可以得出四种菌在pH 值2～11 之间，表面均带负电荷。如图2 可知，三种粒径的N-MNPS 在pH 值2～9 时，表面均带正电荷，所以吸附环境在pH 值2～9 时对带负电荷的细菌静电吸附能力会更强，考虑到大部分病原菌最适生长pH 值7.2～7.6，为保证活菌数量，选择pH 值7.4 作为后续实验体系的pH 值。
图1 不同pH 条件下各细菌的Zeta 电位值Fig.1 Zeta potential of bacteria under different pH conditions
图2 不同pH 条件下N-MNPS 的Zeta 电位值Fig.2 Zeta potential of N-MNPS under different pH conditions
2.2 N-MNTPs 用量及时间对四种病原菌捕获率的结果分析
由图3 可以看出在1 mL 103CFU/mL 的各菌液中加入不同量的N-MNPS，四种菌在N-MNPS 添加量为100 μg 时，捕获率均可达到70%以上，其中除了大肠埃希氏菌O157:H7，其余三种菌均可在磁珠添加量为75 μg 时捕获率达到70%以上。以100 μg 添加量作为最优条件对孵育时间进行优化，如图4 可以看出沙门氏菌在孵育时间为5 min 捕获率就可以达到90%以上，金黄色葡萄球菌和大肠O157:H7 在45 min 时能达到80%，单核细胞增生李斯特菌在45 min 时捕获率为66%。正交试验显著性分析沙门氏菌：粒径有显著影响（p＜0.05），因素主次顺序为粒径＞时间＞添加量；
金黄色葡萄球菌：三因素均无显著影响（p＞0.05），因素主次顺序为粒径＞添加量＞时间；
单核增生李斯特菌：粒径有显著影响（p＜0.05），因素主次顺序为粒径＞时间＞添加量，大肠埃希氏菌O157:H7 粒径有显著影响（p＜0.05），因素主次顺序为粒径＞时间＞添加量，单菌体系中正交实验极差分析最优结果见表3。综合正交结果，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌三者磁珠吸附的最优粒径均为300 nm，大肠埃希氏菌O157:H7 的最优粒径为1 μm，为保证富集病原菌的多样性，后续试验使用300 nm 的N-MNPS富集沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌的混合菌液进行捕获。
图3 单菌体系中N-MNPS 用量对捕获率的影响Fig.3 Effect of N-MNPS dosage on capture rate in single bacteria system
图4 单菌体系中孵育时间对捕获效率的影响Fig.4 Effect of incubation time on capture efficiency in single bacteria system
表2 正交实验极差分析最优结果Table 2 The optimal results of range analysis to orthogonal test
2.3 N-MNTPs 在混菌体系中不同的磁珠添加量和孵育时间的捕获结果分析
在1.5 mL 混菌体系中加入不同量300 nm 粒径的N-MNTPs，不同孵育时间，结果如图5、图6。当磁珠添加量为50 μg，孵育60 min，三种混菌吸附率分别可达到90%以上；
即使在添加量为50 μg，孵育30 min 三种混菌吸附率分别可达60%以上。证明在沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌三种菌的混合体系中，菌体之间并未对捕获率造成很大影响，混合菌体的捕获率达到预期（≥50%）。
图5 合菌体系中磁珠添加量对捕获效率的影响Fig.5 Effect of adding amount of magnetic beads on capture efficiency in mixed bacteria system
图6 合菌体系中孵育时间对捕获效率的影响Fig.6 Effect of incubation time on capture efficiency in mixed bacteria system
2.4 N-MNTPs 在大体积中对混菌的捕获结果分析
依据2.3 的结果，选取300 nm 粒径、50 μg 每1.5 mL添加量、60 min孵育时间作为大体积实验条件。根据反应体系的倍数增大将磁珠添加量提高至500 μg，孵育60 min，分别在10、50 mL 无菌PBS 中，平均添加的混合菌液使其终浓度为103、102CFU/mL。结果如图7 所示，混合菌液浓度为103CFU/mL 时，随着反应体系体积的加大，成倍数加大投入磁珠的量，沙门氏菌捕获率为60%左右，金黄色葡萄球菌的捕获率为75%左右，单核细胞增生李斯特氏菌在反应体系为50 mL 时，捕获率由80%下降至70%；
混合菌液浓度为102CFU/mL 时各菌的捕获率也均可达到55%以上。由此得出，大体积的反应体系与小体积反应体系，在磁珠投入量与反应体系体积比例不变的情况下捕获效率影响并未受到明显影响。证明该优化后的条件可应用至50 mL 的样品前处理稀释液中。
图7 在10 mL 与50 mL 体系中混菌终浓度为103（a）与102（b）时的捕获率Fig.7 The capture rate at the final concentration of 103 (a) and 102 (b) in 10 mL and 50 mL systems
2.5 N-MNTPs 在人工污染样本中的捕获结果分析
牛奶、水果沙拉实际样品中三种病原菌混菌终浓度为102～106CFU/mL（g），加入N-MNTPs 进行捕获。牛奶中混菌的浓度在1×102～1×105CFU/mL 时捕获率从48%～70%逐步增加，在混菌终浓度为1×106CFU/mL时，捕获率下降至50%～60%，在水果沙拉中，混菌终浓度在1×102～1×105CFU/mL 时捕获率从64%～78%逐步增加，在混菌终浓度为1×106CFU/mL 时，捕获率下降至65%～73%。结果如图8 所示，N-MNTPs 对牛奶和水果沙拉中的病原菌捕获效率均大于48%。水果沙拉的基质相比较于牛奶的基质更为复杂，理论上捕获率应低于牛奶基质，但是捕获率更优，证明在食品基质中N-MNTPs 捕获效果较好。
图8 人工污染牛奶（a）和水果沙拉（b）中各菌的捕获率Fig.8 Capture rate of bacteria in artificially contaminated milk(a) and fruit salad (b)
本探究基于N-MNPS 在pH 值为2～9 范围内带正电荷，与表面带负电荷的细菌存在静电吸附作用，确立了在Salmonella typhimurium、Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes三种食源性致病菌菌的混合菌液体系中N-MNPS 对于这三种菌的吸附条件，并将其应用至实际食物样本牛奶以及蔬菜沙拉中。研究初步证实，N-MNPS 的吸附效果于细菌本身是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性细菌无直接关联,通过对细菌的不同pH 值下表面带电情况的研究，侧面证明N-MNPS与细菌间存在很强的静电吸附，同样的结果研究结果也在孙程[16]的研究中被证实，在pH 值为4～8 时对Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes、Escherichia.coliO157:H7 的捕获效率大于70%，100 μg的氨基功能化磁性纳米粒子对102～106CFU/mL 的菌液浓度捕获率菌高于85%。本实验表明，在50 mL 的混菌体系（Salmonella typhimurium、Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes）中，加入550 μg、粒径300 nm的N-MNPS，在孵育60 min时，最低可捕获1×102CFU/mL各菌，捕获效率＞50%。对人工污染的牛奶、水果沙拉进行目标菌捕获，在混合菌终浓度为1×102CFU/mL时也可达到40%以上的捕获率，捕获效率较好。捕获后的细菌提取DNA 可满足下游荧光PCR 检测的检出限要求，免去了繁琐耗时的培养增菌的过程，为后续食品中食源性致病菌的快速检测奠定基础。
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