王 磊 赵志玲 连 霞 金昌洙
滨州医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，滨州医学院山东省肿瘤免疫治疗研究创新团队 山东 烟台 264003
免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)含有6个保守的氨基酸序列(S/I/V/LxYxxI/V/L)[1]，可以招募磷酸酶SHP1、SHP2以及SHIP1，进而抑制免疫细胞的活性。因此，细胞内含有ITIM序列的膜蛋白被统称为免疫抑制受体[2]。
白细胞免疫球蛋白受体亚家族成员B4(leukocyte immunoglobulin like receptor B4，LILRB4)属于免疫抑制受体家族成员，其细胞外包含2个免疫球蛋白样结构域(Ig domain)，细胞内含有3个ITIMs模体。正常情况下，LILRB4主要表达于树突状细胞、单核巨噬细胞、祖肥大细胞和破骨细胞[1,3-4]。LILRB4是急性单核细胞白血病(M4和M5)的表面分子标志物，与ApoE结合后，分泌Arginase和uPar，促进白血病细胞的免疫逃避[5]。LILRB4在非小细胞肺癌中也有较高水平表达，诱导血管生成和肿瘤间质化转变[6]。在肿瘤微环境中，LILRB4表达于髓系来源的各细胞表面，抑制T细胞的活性，促进肿瘤细胞免疫逃避[7]，因此，LILRB4已经成为肿瘤免疫治疗理想靶点。lilrb4是灵长类特有的基因，尽管有文献[1]报道小鼠体内的Gp49b是其同源基因，但其表达模式、结构、功能以及配体与LILRB4均有较大差异，无法完全模拟LILRB4的功能。因此，本研究的主要目的是在小鼠髓系细胞中条件性表达人LILRB4，构建针对人LILRB4免疫耐受小鼠，对于LILRB4在疾病中的作用及功能研究具有重要意义。
1.1 材料 C57BL/6J小鼠购自上海南方模式生物科技有限公司，饲养于滨州医学院SPF级动物房，所有动物实验均已获得滨州医学院医学伦理委员会批准(No.2021-22)。Anti-human LILRB4-APC(Cat#17-5139-42，1∶100，Invitrogen)，Isotype-APC(Cat#17-4172-42，1∶400，Invitrogen)，Anti-mouseCD11b-PE(Cat # 301330，1∶200，Biolegend)。琼脂糖购自Biosharp公司，异氟烷购自深圳瑞沃德生命科技有限公司，小鼠基因型快速鉴定试剂盒购自Transgene公司。
1.2 仪器 小鼠麻醉仪购自深圳瑞沃德生命科技有限公司，C6-Plus 流式细胞仪购自BD公司，小型高速冷冻离心机购自Eppendorf公司，琼脂糖电泳仪、PCR仪、凝胶成像仪均购自Bio-Rad公司。
1.3lilrb4基因条件性表达小鼠的构建 应用CRISPR/Cas9技术在rosa26基因位点通过同源重组的方式插入人lilrb4基因编码序列，序列前含有一个两侧带有LoxP序列的转录终止序列，在Cre重组酶存在的情况下可以识别LoxP序列后将转录终止序列切除进而启动下游lilrb4的表达。lilrb4基因条件性表达小鼠构建策略见图1A。首先通过体外转录获得Cas9 mRNA及gRNA序列(GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG)，然后构建同源重组载体，该载体含有3′同源臂CAG-LSL-LILRB4-WPRE-polyA5′同源臂，载体图谱见图1B。将Cas9 mRNA、gRNA及同源重组载体显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。PCR及测序鉴定阳性的F0代小鼠，与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠。F1代小鼠进行自交获得纯合的小鼠命名为Rose26LSL/LSL，然后与Lyz2-Cre小鼠杂交获得Rose26LSL/-;Cre。Rose26LSL/-;Cre再进行自交获得髓系细胞上条件性表达人LILRB4的小鼠，命名为Rose26LSL/LSL;Cre。
A.小鼠构建策略示意图；
B.同源重组载体质粒图谱；
C.lilrb4表达序列PCR引物鉴定策略，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别代表引物P1、P2、P3、P4的位置。
1.5lilrb4基因条件性表达小鼠的鉴定
1.4 人与小鼠lilrb4基因及蛋白的同源性分析 利用NCBI数据库分别找到人与小鼠lilrb4基因CDS及蛋白质氨基酸序列，将得到的序列进行对比分析相似性。
以手机学习平台为主的智慧课堂在外语教学中得到广泛运用，符合当今信息时代发展的需要。以核心素养培养为目标的高职大学英语教学新模式主要从教学内容选择、教学设计和教学评价三方面提出智慧教学模式设计思路，并对实施过程进行探索。
1.6 统计学方法 应用Prism8.0软件进行统计学分析。定量资料采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
1.5.1 基因型鉴定 根据表达序列插入位点设计特异性引物，应用PCR扩增目的条带，lilrb4表达小鼠基因型鉴定策略见图1。Lilrb4表达序列引物序列如下：P1 5′-TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA-3′；
P2 5′-TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA-3′；
P3 5′-AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG-3′；
P4 5′-AGACAGAAGGCAACTGAGCC-3′。Cre表达序列鉴定引物如下：P5 5′-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3′；
P6 5′-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3′；
P7 5′-TTACAGTCGGCCAGGCTGAC-3′。反应体系如下：模板2 μL，正向引物(10 μM)0.2 μL，反向引物(10 μM)0.2 μL，2×TransDirect Mouse Genotyping SuperMix 10 μL，高压灭菌水2.6 μL。
2.2 Rose26LSL/LSL;Cre和Rose26LSL/LSL小鼠基因型的鉴定 根据1.5.1的基因型鉴定策略，lilrb4表达序列纯合子小鼠引物P1/P2不能扩增出片段，P3/P4能够扩增出408 bp片段。cre阳性小鼠P5/P6可以扩增出700 bp片段，P6/P7扩增出350 bp片段，而cre阴性小鼠只有P6/P7扩增出350 bp片段。PCR结果显示，以Rose26LSL/LSL;Cre鼠耳作为模板，lilrb4鉴定组只有引物P3/P4扩增出408 bp目的片段(图3A)，cre鉴定组P5/P6扩增出700 bp片段，P6/P7扩增出300 bp片段(图3B)；
以Rose26LSL/LSL鼠耳作为模板lilrb4鉴定组只有引物P3/P4扩增出408 bp目的片段(图3C)，cre鉴定组P5/P6未能扩增出片段，P6/P7扩增出300 bp片段(图3D)。
2.1 人lilrb4与小鼠Gp49b基因及蛋白同源性分析 人lilrb4基因的编码序列为1 347个碱基(NM_001278426.4)，编码448个氨基酸组成的蛋白质(NP_001265355.2)。小鼠Gp49b基因的编码序列为1 008个碱基(NM_013532.3)，编码335个氨基酸组成的蛋白质(NP_038560.1)。NCBI数据库比对人lilrb4与小鼠Gp49b基因编码序列的同源性，结果表明：在1-411及990-1100基因位点分别有72%的同源性，而412-989未发现任何同源序列(图2A)。蛋白比对发现：在1-373位置上的氨基酸有41%的相似性，而在386-415位点仅有27%的同源性，其余未找到相似序列(图2B)。以上结果表明，人lilrb4与小鼠Gp49b基因及蛋白同源性较差，小鼠的Gp49b基因不能完全模拟人lilrb4的功能。
主要实验仪器：HWCL-3恒温油浴锅(郑州长城科工贸易有限公司)，pHS-2型酸度计(上海盛磁仪器有限公司) ，T6紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，S-3000N台式扫描电子显微镜(日本株式会社日立制作所)，VERTEX-33 傅里叶变换红外光谱仪(Bruker Optik GMBH公司)。
说出来。在自己情绪消极时，倾诉的对象就有限制了，一定要找一个充满正能量的人作为倾诉的对象，把自己的失望、气恼、伤感等说出来。只有把消极的东西说出来，人才有可能装入积极的东西。说出来，就是从可信赖的朋友或同事那里寻求安慰和帮助，缓解消极情绪。
A.人lilrb4与小鼠Gp49b基因CDS序列比对；
B.人LILRB4与小鼠gp49蛋白序列对比。
1.5.2 细胞水平LILRB4表达情况检测 从Rose26LSL/LSL和Rose26LSL/LSL;Cre小鼠的球后静脉取血，加入红细胞裂解液30 min后，PBS洗涤1遍，进行抗体染色。分别利用CD11b-PE、Isotype-APC，CD11b-PE、LILRB4-APC组合在髓系细胞上检测LILRB4的表达水平，然后将Rose26LSL/LSL和Rose26LSL/LSL;Cre小鼠麻醉状态下处死，分离小鼠骨髓并制备成单细胞悬液，通过70 μm细胞滤器进行过滤，PBS洗涤重复上述染色。
A.Rose26LSL/LSL;Cre小鼠lilrb4表达序列鉴定组中1、3、5泳道为P1/P2引物扩增片段，2、4、6泳道为P3/P4引物扩增片段(408 bp)；
B.cre表达序列鉴定组中 1、3、5泳道为P5/P6引物扩增片段(700 bp)，2、4、6泳道为P6/P7引物扩增片段(350 bp)；
C.Rose26LSL/LSL小鼠lilrb4表达序列鉴定组中1、3、5、7泳道为P1/P2引物扩增片段，2、4、6、8泳道为P3/P4引物扩增片段(408 bp)；
D.cre表达序列鉴定组中1、3、5、7泳道为P5/P6引物扩增片段，2、4、6、8泳道为P6/P7引物扩增片段(350 bp)。M为DNA Ladder。
2.3 髓系细胞中人LILRB4的表达 流式细胞仪检测结果表明,在Rose26LSL/LSL;Cre小鼠外周血CD11b阳性的髓系细胞中检测到了人LILRB4的表达，而在Rose26LSL/LSL小鼠中未检测到人LILRB4的表达(图4A)。平均荧光强度统计分析结果验证了该结论(图4B)。骨髓中染色结果与外周血一致，仅在Rose26LSL/LSL;Cre的小鼠的骨髓髓系细胞中检测到了LILRB4的表达(图4C)。
A.外周血CD11b阳性髓系细胞中LILRB4的流式检测图；
B.外周血CD11b阳性的髓系细胞中LILRB4表达的平均荧光强度统计分析；
C.骨髓中CD11b阳性髓系细胞中LILRB4的流式检测图。MFI为平均荧光强度；
**P<0.01。
LILRBs家族有5个成员，主要表达于造血系细胞中，并抑制多种免疫细胞的激活。由于LILRBs的免疫抑制功能与CTLA4、PD-1等免疫反应靶点的功能类似，因此，LILRBs被认为是免疫反应靶点分子[8]。LILRBs家族中的LILRB4作为M4、M5型急性髓系细胞白血病的分子标志物，通过免疫反应靶点作用促进肿瘤的免疫逃避，并作为肿瘤支持因子促进肿瘤细胞的发生发展[5]。LILRB4在肿瘤浸润的免疫细胞中表达水平明显升高，这提示，未来应用LILRB4的免疫治疗效果有望达到目前已在临床上应用的PD-1抑制剂[9]的水平。
我回到房间，在想这突如其来的来自隔壁的好意，究竟是什么意思，看着那个精致的果盘上摆满的玲珑剔透的水果上细细的牙签，我觉得这些牙签分分钟都有可能插进我的喉咙，要了我的命。我将果盘中的水果都倒进了厨房的垃圾桶里，一个不留。我觉得我做得对，我甚至都不知道她的名字。
小鼠和人类在遗传和病理生理方面具有相似性。基因工程小鼠模型是研究人类疾病的最佳选择，特别是Cre-LoxP系统广泛用于条件性模型构建，并以特定的方式研究组织/细胞(空间控制)或时间(时间控制)的相关基因[10]。灵长类lilrb4基因在小鼠体内的同源基因为Gp49b。有文献[9,11]报道，利用全身敲除Gp49b的小鼠模型证明lilrb4在实体瘤发展过程中抑制免疫反应以及在病毒感染后可以调控NK细胞的功能。虽然都含有2个免疫球蛋白样胞外域，但LILRB4胞内域含3个ITIMs模体，而gp49B仅有2个ITIMs模体，且两者的同源性较差，gp49B并不能完全模拟LILRB4在体内的功能。因此，gp49B全身敲除的小鼠并不是理想的研究LILRB4的模型。目前尚未见报道关于灵长类LILRB4在小鼠体内过表达的研究。本研究通过构建在髓系细胞条件性表达灵长类lilrb4基因的小鼠模型，成功解决了小鼠对人LILRB4产生免疫排斥的问题，为未来LILRB4应用于肿瘤免疫治疗的研究提供了一个较为理想的小鼠模型。
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