杨 迪 孙 娟 郑雪嫚
2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一种以慢性高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病,在我国的发生率越来越高。
糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病慢性微血管并发症之一,是T2DM患者致残、致死的最常见原因之一[1]。
其诊断依靠蛋白尿(albuminuria, AU)的检出。
尿微量白蛋白/肌酐比值(urinary albumin to creatinine ratio, UACR)是反映糖尿病患者白蛋白排泄的可靠指标,可作为DN的早期筛查项目[2]。
越来越多的证据表明,T 淋巴细胞诱导的炎性反应和2 型糖尿病及糖尿病肾病密切相关,免疫机制可能参与其中[3,4]。
外周血成熟T 淋巴细胞主要有CD4+和CD8+两个亚群,CD4+与CD8+比例的相对稳定,是维持机体免疫调控的关键。目前对CD4+/CD8+在2 型糖尿病及糖尿病肾病中的认识相对较少,且存在分歧。
因此,本研究回顾性分析2 型糖尿病患者、2 型糖尿病合并AU 患者及健康人群外周血中CD4+T 细胞、CD8+T 细胞计数及CD4+/CD8+比值,探讨CD4+/CD8+比值失衡在2 型糖尿病合并AU 的发生、发展中的作用,为2 型糖尿病肾病的免疫病理机制、病情监测、指导临床治疗等提供理论依据。
1.研究对象：回顾性收集2020年3月～2021年6月于徐州医科大学附属医院内分泌科住院的595例2 型糖尿病患者,均符合《中国2 型糖尿病防治指南(2017年版)》的糖尿病诊断标准[5]。
排除标准：①1 型糖尿病和特殊类型糖尿病;②合并糖尿病酮症酸中毒、高渗性高血糖状态等急性并发症;③年龄＜18岁或＞80 岁者;④合并严重心脏、肝脏、肾脏等器质性疾病者;⑤患有慢性炎症性疾病、恶性肿瘤、血液性疾病者;⑥各种应激(各种精神刺激、外伤、手术、疼痛);⑦糖皮质激素及其他免疫抑制剂等药物应用史;⑧妊娠期及哺乳期女性。
根据《中国糖尿病肾脏疾病防治临床指南》,将患者分为两组,至少3 个月两次UACR 均≥30mg/g 为2 型糖尿病合并蛋白尿组(AU 组),共266 例(男性126 例,女性140 例),UACR ＜30mg/g 为2 型糖尿病不合并蛋白尿组(非AU 组),共329 例(男性154 例,女性175 例)[6]。
其中UACR 30 ～300mg/g 为微量蛋白尿,UACR ＞300mg/g 为大量蛋白尿。
另选取同期于徐州医科大学附属医院体检的154 例(男性76 例,女性78 例)健康人群作对照组(NC 组)。
对照组筛选标准：空腹血糖均＜6.1mmol/L,餐后2h 血糖均＜7.8mmol/L,无心脏、脑、肾脏疾病史,无风湿免疫性疾病及恶性肿瘤病史。
本研究经徐州医科大学附属医院医学伦理学委员会审批(伦理审批号：XYFY2021-KL128-01)。
2.研究方法：回顾性研究,收集各组研究对象的一般资料包括：性别、年龄、身高、体重、收缩压(systolic blood pressure, SBP)、舒张压(diastolic blood pressure, DBP)、糖尿病病程,并计算体重指数(body mass index, BMI) = 体重(kg)/身高2(m2)。
所有患者均于入院48h 内空腹状态下采集静脉血(所有患者采血前一天避免饮酒和高脂肪蛋白饮食),于徐州医科大学附属医院检验科检测肌酐(creatinine, Cr)、尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin A1c, HbA1c)、 空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)、超敏C 反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein, hsCRP)及外周血CD4+T、CD8+T、CD3+T 细胞计数,并计算CD4+/CD8+比值。
3.统计学方法：应用SPSS 26.0 统计学软件对数据进行统计分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验,3 组间比较采用单因素方差分析。
不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)[M(Q1,Q3)]表示,两组间比较采用Mann-Whitney U检验,3 组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。
计数资料组间比较采用χ2检验。
采用偏相关分析评价相关性。
二元Logistic回归分析用于2 型糖尿病患者发生蛋白尿的影响因素,以P＜0.05 为差异有统计学意义。
1.各组临床资料比较：3 组间年龄、性别、TC、LDL-C 比较,差异均无统计学意义(P均＞0.05)。与NC 组比较, 非 AU 组患者 HbA1c、 FPG、 TG、hsCRP、CD3+T 细胞计数、CD8+T 细胞计数显著升高,HDL-C 显著降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05); AU 组患者 BMI、 DBP、 HbA1c、 FPG、 TG、hsCRP、CD8+T 细胞计数显著升高,HDL-C、CD4+/CD8+显著降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05)。与非AU 组比较,AU 组患者糖尿病病程、SBP、DBP、Cr、UACR、hsCRP 水平显著升高,CD4+T 细胞计数、CD4+/CD8+显著降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05),详见表1。
表1 各组临床资料比较[n(%),±s,M(Q1,Q3)]
表1 各组临床资料比较[n(%),±s,M(Q1,Q3)]
与NC 组比较,*P ＜0.05,**P ＜0.001;与非AU 组比较,Δ P ＜0.05,ΔΔ P ＜0.001
项目NC 组(n =154)非AU 组(n =329)AU 组(n =266)F/z/χ2P年龄(岁)58.16 ±9.1555.45 ±12.1456.63 ±13.092.7670.064男性/女性76/78154/175126/1400.2760.871糖尿病病程(年)-5.00(1.00,12.00)10.00(3.00,15.00)△△-3.523＜0.001 BMI(kg/m2)24.66 ±2.9125.34 ±3.2526.01 ±3.73**8.188＜0.001 SBP(mmHg)132.71 ±15.75129.07 ±15.47135.89 ±17.80△△12.806＜0.001 DBP(mmHg)80.42 ±11.1882.64 ±10.0785.02 ±11.29**△9.324＜0.001 Cr(μmol/L)59.50(51.00,68.00)59.00(51.00,67.20)63.00(53.00,77.00)△△19.453＜0.001 UACR(mg/g)-10.33(5.88,16.63)78.35(44.78,233.71)△△-20.758＜0.001 HbA1c(%)5.70(5.50,5.90)8.80(7.20,10.50)**8.95(7.40,10.60)**332.391＜0.001 FPG(mmol/L)5.10(4.80,5.43)8.49(6.44,11.22)**8.72(6.88,11.24)**280.951＜0.001 TC(mmol/L)4.71 ±1.014.82 ±1.254.88 ±1.360.8890.412 TG(mmol/L)1.23(0.90,1.58)1.43(1.04,2.31)**1.61(1.09,2.74)**27.936＜0.001 HDL-C(mmol/L)1.21 ±0.291.05 ±0.28**1.04 ±0.35**18.500＜0.001 LDL-C(mmol/L)2.81 ±0.832.85 ±0.922.77 ±1.070.5240.592 hsCRP(mg/L)0.80(0.50,1.30)1.20(0.60,2.20)**1.60(0.90,2.90)**△45.694＜0.001 CD3 + T 细胞计数(个/微升)1436(1100,1740)1502(1140,1924)*1428(1056,1820)6.2840.043 CD4 + T 细胞计数(个/微升)809 ±282867 ±321781 ±319△5.9020.003 CD8 + T 细胞计数(个/微升)551(424,684)616(476,800)*630(444,836)*13.5440.001 CD4 + /CD8 +1.38(1.11,1.75)1.36(1.10,1.66)1.16(0.90,1.50)**△△36.425＜0.001
2.2 型糖尿病患者UACR 水平与各指标的相关性分析：相关分析显示,2 型糖尿病患者UACR 水平与年龄、糖尿病病程、SBP、DBP、BMI、Cr、hsCRP 呈正相关,与CD3+T 细胞计数、CD4+T 细胞计数、CD4+/CD8+呈负相关(P＜0.05)。
在调整年龄、性别、SBP、DBP 后,UACR 与Cr、CD3+T 细胞计数、CD4+T 细胞计数、CD4+/CD8+的相关性差异仍有统计学意义(P＜0.05),详见表2。
表2 UACR 与各指标的相关性
3.CD4+/CD8+与T2DM 合并AU 影响因素的Logistic回归分析：将各个变量进行单因素Logistic回归分析,结果显示,病程、BMI、SBP、DBP、Cr、CRP、CD4+、CD4+/CD8+是T2DM 合并AU 的影响因素(P＜0.05)。
将上述变量纳入多因素Logistic逐步回归分析,结果显示,DM 病程、SBP、Cr、hsCRP 水平升高、CD4+/CD8+降低可能是T2DM 合并AU 的危险因素(P＜0.05),详见表3。
表3 CD4+ /CD8+与T2DM 合并AU 的关系
4.不同程度的蛋白尿患者外周血CD4+/CD8+与UACR 的相关性分析：在调整年龄、病程、血压、BMI、Cr、hsCRP、TC、TG、HDL-C、LDL-C 后,微量蛋白尿组患者外周血CD4+/CD8+与UACR 呈负相关(r=-0.345,P＜0.001),大量蛋白尿组患者外周血CD4+/CD8+亦与UACR 呈负相关(r=-0.599,P＜0.001),详见表4。
表4 不同程度的蛋白尿患者外周血CD4+ /CD8+与UACR 的相关性
5.不同程度的蛋白尿患者外周血T 淋巴细胞群比较：与微量蛋白尿组患者比较,大量蛋白尿组患者CD3+T 细胞计数、CD4+T 细胞计数、CD4+/CD8+显著降低(P＜0.05),详见表5。
表5 不同程度的蛋白尿患者外周血T 淋巴细胞群比较[±s,M(Q1,Q3)]
表5 不同程度的蛋白尿患者外周血T 淋巴细胞群比较[±s,M(Q1,Q3)]
项目微量蛋白尿组(n =209)大量蛋白尿组(n =57)z/tP CD3 + T 细胞计数(个/微升)1540(1176,1936)1256(940,1620)-2.7000.007 CD4 + T 细胞计数(个/微升)825 ±307619 ±3124.474＜0.001 CD8 + T 细胞计数(个/微升)636(440,836)628(472,816)-0.1220.903 CD4 + /CD8 +1.22(0.96,1.53)0.82(0.67,1.10)-5.382＜0.001
糖尿病肾病是糖尿病慢性微血管并发症之一,其发病机制与多种因素密切相关,除糖脂代谢紊乱、血流动力学异常、氧化应激、遗传因素等原因外,免疫系统紊乱也是DN 发生的重要原因[7～9]。
T 淋巴细胞作为人体最重要的免疫细胞之一,在维持机体免疫功能和免疫自稳中发挥着重要作用。
T 淋巴细胞主要包括CD4+细胞和CD8+细胞,是细胞免疫应答中的首要细胞,体内CD4+和CD8+相互调控、保持平衡,维持机体的正常免疫功能,其数量和(或)功能异常使机体平衡打破,免疫功能紊乱,导致疾病发生[10～12]。
本研究中与对照组及不合并蛋白尿组比较,糖尿病合并蛋白尿患者外周CD4+/CD8+显著降低,这与既往研究结果基本一致[13]。
表明糖尿病合并蛋白尿患者出现了T 淋巴细胞各群比例的异常,尤其是CD4+细胞在外周的免疫自稳,并且随着蛋白尿的发展表现更明显,糖尿病合并蛋白尿患者的免疫功能处于抑制或者紊乱状态。
在糖尿病蛋白尿动物模型中给予可溶性CTLA4-Fc 融合蛋白Abatacept 抑制T淋巴细胞活化,在预防和干预两种模式下均可减少蛋白尿,表明淋巴细胞参与了糖尿病蛋白尿的发生[14]。
T 淋巴细胞可能通过在肾脏组织异常浸润及分泌多种促炎性细胞因子参与糖尿病肾病的发生[15,16]。
CD4+细胞可分化为Th17,分泌白细胞介素-17 (interleukin-17,IL-17),而IL-17 可刺激促炎性细胞因子,如IL-6、TNF-α 的产生[17]。
IL-6 在免疫调节和介导炎性反应中发挥着重要作用,它可促使T 淋巴细胞成为效应细胞、促进巨噬细胞增值、刺激血管内皮细胞因子释放,导致肾小管内皮细胞受损,通透性增强,促进DN 的发生[18]。
TNF-α可诱发炎性反应,增强白细胞对损伤的免疫反应,作用于单核-吞噬细胞,促进白三烯、前列腺素和IL-4等炎性介质的释放,引起组织损伤和β 细胞功能衰竭[16]。
曾夙莉等[19]研究发现,DN 患者组CRP、IL-6、IgA、IgM 高于对照组,CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IgG低于对照组,可见DN 患者体内存在不同程度的微炎症和免疫功能下降。
不同淋巴细胞之间的比例发生改变,提示长期慢性高血糖状态可影响T 淋巴细胞的外周动态平衡,使T2DM 患者的免疫稳定性遭到破坏,易出现各种并发症。
Logistic回归分析显示,糖尿病病程、SBP、Cr、hsCRP 水平升高、CD4+/CD8+降低可能是2 型糖尿病合并蛋白尿的危险因素。
因此,当外周血CD4+/CD8+降低时,机体的免疫状态紊乱,从而导致蛋白尿的发生。
笔者还根据UAER 水平对糖尿病合并蛋白尿患者进行分组,结果显示,与微量蛋白尿组患者比较,大量蛋白尿组患者CD4+T 细胞计数、CD4+/CD8+更低,CD4+/CD8+与UACR 的相关性更强,提示CD4+/CD8+水平随着蛋白尿严重程度的增加而降低,且大量蛋白尿患者CD4+/CD8+水平降低幅度较微量蛋白尿患者更加明显。
CD4+/CD8+比值失衡可能在糖尿病蛋白尿的发生、发展中扮演了重要角色。
综上所述,糖尿病合并蛋白尿患者CD4+/CD8+比值降低,且随着UACR 水平升高而降低。
CD4+/CD8+降低可能是T2DM 合并蛋白尿的危险因素,CD4+/CD8+比值失衡可能在2 型糖尿病患者蛋白尿的发生、发展中起重要作用,但T 淋巴细胞在引起糖尿病性肾损伤中的具体机制需进一步研究探讨。
因此,在预防和治疗糖尿病肾病方面,通过细胞免疫进行评估,以及针对性的免疫调节干预,有助于了解T2DM 患者的免疫状态和疾病进程。
本研究也存在一定的局限性,DN 诊断的金标准是行肾脏穿刺病理检查,T2DM 患者出现蛋白尿并非DN 引起,本研究亦未能进一步观察降尿蛋白治疗后CD4+/CD8+的变化,这仍需开展大样本量、多中心、前瞻性研究予以验证。
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