谢润娟 周振忠 张 超 谢 云
1.内江市第二人民医院输血科 (内江 四川， 641000) 2.内江市第二人民医院检验科 3.内江市第二人民医院病理科 4.内江市第二人民医院肿瘤外科
慢性乙型病毒性肝炎(CHB)是世界上最常见的慢性感染性疾病之一，据估计有2.57亿慢性感染者，是全球肝细胞癌(HCC)的主要致病原因[1]。每年约有88万人死于CHB并发症[2]。肝癌是继肺癌之后全球范围内第2大最常见的癌症死亡原因，主要由乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染引起，发病率不断上升，每年约有80万新增病例[3，4]。因此，探究HBV相关肝癌的发病机制对于临床诊断和治疗该病具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一种小的非编码RNA，能够调节细胞的增殖、分化和凋亡等。最近的研究报告指出多种miRNA在肝病患者的肝组织中异常表达，可能有助于诊断病因或判断肝病的进展[5，6]。miR-92是miR-17-92家族成员，研究证明miR-92可以促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，在肿瘤的发生过程中发挥重要作用[7]。中期因子(MDK)是一种肝素结合生长因子，在胚胎发生过程中强烈表达，其表达在正常成人组织中微弱或无法检测到[8]。研究表明，大多数HCC中血清MDK升高，可能对早期肿瘤具有诊断作用[9]。本研究通过检测CHB相关肝癌患者癌组织及癌旁组织中miR-92、MDK水平，探究二者在该病中的表达水平及临床意义，以期为临床诊治HBV相关肝癌提供参考。
1.1 一般资料 2015年8月至2017年8月我院收治由CHB导致HCC并行肝癌切除术的患者66例为研究对象，男43例，女23例，年龄49～82岁，平均58.48±7.35岁，选取术中切除的癌组织及癌旁组织分别作为HCC组和对照组。依据美国癌症协会肝癌TNM分期将患者分为Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期21例，分期越高，恶性程度越严重。
1.2 纳入及排除标准 纳入标准：①均经病理切片证实为HCC；
②患者术前未在本院或其他医院接受放疗、化疗或分子靶向治疗；
③肝炎病毒检测显示HBsAg阳性，无其他类型病毒感染；
④患者病历资料完整，有完整随访记录。
排除标准：①非首次进行肝癌切除术者；
②患有严重的肝肾功能不全、衰竭或心脑血管疾病；
③患有自身免疫性肝病、脂肪性肝病等导致肝功能异常或继发性肝癌。本研究通知患者及家属知情并同意签字，且经本院伦理委员会批准通过，符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》。
1.3 主要试剂与仪器 实时荧光定量PCR仪型号7300型(美国Applied biosygtems公司)；
紫外-可见分光光度计、-80℃超低温冰箱(美国Thermo Scientific公司)；
引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。Trizol试剂(美国Invirotrogen公司)；
反转录试剂盒(上海振誉生物科技有限公司)；
SYBR Premix Ex Taq TM实时PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)；
免疫组化仪器：全自动安捷伦，设备名称：AS Link48全自动免疫组化染色机；
MDK一抗、羊抗兔IgG二抗(英国Abcam公司)；
链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP)试剂盒(福州迈新生物科技有限公司)；
二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒(福州迈新生物科技有限公司)。
1.4 研究方法
1.4.1 样品采集及保存 所有患者样本均取自本院保存于10%的中性福尔马林溶液固定、常规石蜡包埋后存档的样本。
1.4.2 miR-92、MDK mRNA表达水平 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法分别检测HCC组织和癌旁正常组织中miR-92、MDK mRNA的表达水平。应用Trizol法提取癌组织及癌旁组织总RNA，分光光度计测定总RNA纯度，按照逆转录试剂盒说明进行操作。参照SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒说明书进行qRT-PCR反应，内参分别选用U6、GAPDH基因，miR-92、MDK mRNA、U6、GAPDH引物序列见表1。反应条件为：95℃，10 min；
(95℃，10 s；
60℃，20 s；
72℃，15 s)40个PCR循环。采用2-△△Ct方法计算HCC组织和癌旁正常组织各自的miR-92、MDK mRNA相对表达量。
表1 qRT-PCR引物序列
1.4.3 MDK表达及免疫组化结果判定 免疫组化法分别检测HCC组织和癌旁正常组织中的MDK表达及免疫组化结果判定。操作步骤：①石蜡切片(4 μm)经二甲苯、递减浓度乙醇溶液至水洗进行脱蜡、水化；
②经0.01 mmol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)煮沸20 min；
③滴加3%过氧化氢，然后室温孵育10 min；
④洗涤后滴加1%牛血清白蛋白，室温封闭30 min；
⑤弃去封闭液，再滴加一抗(MDK抗体1∶100稀释)，4℃孵育过夜；
磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，洗涤后滴加生物素标记二抗，37℃孵育40 min；
⑥再次用PBS洗涤，洗涤后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液；
洗涤后常规DAB显色、苏木素复染；
⑦经递增浓度乙醇溶液、二甲苯进行脱水、透明；
⑧中性树胶封片，光学显微镜下观察拍照。
免疫组化染色以出现棕黄色颗粒为阳性表达，根据细胞阳性率评分和染色强度给予免疫组化评分。细胞阳性率评分：0分(<5%)，1分(5%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(>75%)。染色强度评分：未着色或淡染记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，深褐色记3分。染色指数(SI)为细胞阳性率评分与染色强度评分乘积，以SI<2为阴性表达，SI≥2为阳性表达。
1.4.4 随访 所有患者均通过门诊复查或打电话的方式进行随访，随访期限为从患者手术完成至随访截止，或死亡、失访的日期。随访开始于2015年8月，截至2020年8月，记录患者手术后疾病进展及生存时间。
2.1 两组患者组织miR-92、MDK表达水平比较 见表2。
表2 miR-92、MDK表达水平比较
2.2 MDK表达水平比较 免疫组化结果显示，MDK主要存在于胞质中，胞核无染色，癌旁正常组织中MDK阳性率低于HCC组织(34.85%vs74.24%，χ2=20.656，P<0.01)。见图1。
图1 MDK在癌旁正常组织及HCC组织中的表达(×400)
2.3 HCC组织中miR-92、MDK表达水平与预后的关系 K-M法分析显示，HCC患者5年累积生存率为56.06%(37/66)，MDK阳性表达患者5年生存23例，MDK阴性表达患者5年生存14例，MDK阳性表达患者5年累积生存率低于MDK阴性表达患者(46.94%vs82.35%，Log-rank =6.426，P<0.05)；
miR-92高表达患者5年生存19例，低表达患者5年生存18例，miR-92高表达患者5年累积生存率低于miR-92低表达患者(42.22%vs85.71%，Log-rank=10.995，P<0.05)。见图2、3。
图2 HCC组织中miR-92表达水平与预后的关系
图3 HCC组织中MDK表达水平与预后的关系
2.4 影响HCC患者预后的COX危险因素分析 见表3。单因素COX分析显示，组织分化、TNM分期、门脉癌栓、肿瘤转移、miR-92、MDK均是影响HCC不良预后的危险因素；
多因素COX分析显示，TNM分期、miR-92、MDK水平偏高均是HCC不良预后的危险因素。
表3 影响HCC患者预后的COX危险因素分析
2.5 miR-92、MDK表达与临床病理特征的关系 以SI<2为阴性表达，SI≥2为阳性表达，分为MDK阴性组和阳性组；
以HCC组miR-92表达平均值为界值，分为miR-92低表达组与高表达组。HCC患者中miR-92、MDK表达与组织分化、TNM分期有关(P<0.05)，而与患者年龄、门脉癌栓、肿瘤转移无关(P>0.05)。见表4。
表4 miR-92、MDK表达与临床病理特征的关系
HCC约占原发性肝癌的90%，是全球第5大常见癌症，而病毒性肝炎是造成大多数HCC的主要原因，全世界HBV感染的发病率约为54%[10]。在成人中，高达70%的HBV相关肝癌病例表现为亚临床肝炎，转氨酶升高，高达30%的病例出现短暂性黄疸和流感样前驱症状[1]。虽然急性HBV感染也可导致重型肝炎合并肝衰竭的发生；
但CHB的临床过程通常是不明显的，发展为肝硬化或HCC的过程可能会在数十年内缓慢进行，直到晚期肝病才明显，预后较差。血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和甲胎蛋白等肝酶水平可提供对肝功能的深入了解，但传达的信息有限，并且经常直到晚期肝癌才检测。因此，更敏感的生物标志物可能有助于在慢性肝炎患者中实现早期发现，miRNA即代表了一种监测肝癌的有前途的方法。
miRNA是一类非编码单链RNA(20～24个核苷酸)，由高级真核生物的基因组编码，成熟的miRNA通过一系列在细胞核和细胞质中的加工步骤形成[11]。研究发现，miR-92在肝癌中表达上调，可以抑制细胞凋亡，促进侵袭和转移，充当肿瘤抑制因子或致癌基因[12]。MDK是一种新型的肝素结合生长因子，约15KD，富含碱性氨基酸和半胱氨酸，在正常成人组织中弱表达或检测不到，但在胚胎发育过程中强烈表达[13]。MDK在多种人类癌症中异常高表达，包括食道癌、胆囊癌、肝癌等，被发现通过促进许多肿瘤特异性功能，包括细胞生长、肿瘤细胞存活、细胞迁移和致癌作用而加剧疾病进展[14，15]。本研究发现，HCC组患者组织中miR-92、MDK mRNA表达水平较对照组升高，提示miR-92、MDK mRNA异常表达可能与CHB相关肝癌有关。免疫组化结果也显示，MDK主要存在于胞浆中，胞核无染色，癌旁正常组织中MDK阳性率低于HCC组织。亦表明MDK异常高表达可能参与疾病的致病过程中。钱涛等[16]发现，MDK在肝内胆管癌(ICC)患者肿瘤组织中高表达，与肿瘤分期、淋巴结转移、分化程度有关，可作为ICC的肿瘤标记物，提示其恶性程度及患者预后情况。本研究发现，HCC患者中miR-92、MDK表达与组织分化、TNM分期、门脉癌栓、肿瘤转移有关，表明miR-92、MDK表达与HBV相关肝癌密切相关，高表达的miR-92、MDK可能共同促进了肿瘤细胞的增殖、分化、迁移等。经K-M法分析显示，miR-92高表达患者5年累积生存率高于miR-92低表达患者；
MDK阳性表达患者5年累积生存率低于MDK阴性表达患者，提示miR-92、MDK表达水平与HBV相关肝癌患者预后不良密切相关。多因素COX分析显示，TNM分期、miR-92、MDK水平偏高均是HCC不良预后的危险因素，亦提示miR-92、MDK与HB相关肝癌预后有关。
综上所述，miR-92、MDK在HBV相关肝癌组织中高表达，与组织分化、TNM分期、及预后情况有关，是不良预后的危险因素。本研究也存在未对血清中miR-92、MDK水平进行联合检测，下一步可结合二者在血清中表达水平，进行进一步研究。
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