甘丽华，杨 坤，李志敏，何 泉，郭超峰
1 广西中医药大学，广西 南宁 530000；
2 广西中医药大学第一附属医院
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性消化道炎症疾病，目前病因尚未明确，被世界各国卫生组织列为疑难性疾病之一［1］，以结直肠黏膜屏障破坏，肠道菌群紊乱，弥漫性炎症改变为特点。患者常表现为腹痛、腹泻、里急后重及黏液脓血便等特点。西医认为UC多与免疫应答与炎症反应有关，采用氨基水杨酸类、糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗［2-3］，但需长期使用，易对药物产生依赖性，不耐受，继发新的感染，达不到理想治疗效果。UC 属中医学“泄泻”“痢疾”“肠辟”等范畴，主要病机为湿热蕴结肠道，气血不调［4］，治疗以化湿为主，辅以清热解毒或健脾等法。
据2015 版《中华人民共和国药典》记载青黛是蓼科植物蓼蓝，爵床科植物马蓝和十字花科植物菘蓝的茎或叶加工后的干燥粉末或颗粒，具有清热解毒、凉血消斑等功效［5］。《本经逢源》中记载青黛具有“散郁火，治温毒发斑及产后热痢下重”的功效。陈铭诗［6］采用复方青黛颗粒联合美常安治疗UC，可降低患者疾病活动指数，增加T淋巴细胞水平，调节机体免疫，保护肠黏膜屏障。马文强等［7］研究青黛在UC 模型小鼠的体内作用机制，发现青黛能有效抑制小鼠体内炎症因子和细胞凋亡因子释放，提高抗凋亡因子水平，阻断炎症形成。日本单中心研究发现，患者口服青黛治疗UC后出现肝损伤，恶心头痛，感染性结肠炎等不良反应但停药后可逆［8］。
目前青黛基于网络药理学研究尚少［9］。现采用网络药理学方法探讨青黛治疗UC的作用机制。
1.1 应用数据库及相关软件中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、通用蛋白质数据库Uniprot（https：//www.uniprot.org/）、人类基因数据库Gene Cards（https：//www.genecards.org/）、R 语言分析软件R3.6.1（https：//www.r-project.org/）、网络拓扑属性分析软件Cytoscape 3.7.2（http：//cytoscape.org/）、蛋白质互作平台String（https：//www.string-db，org/）、生物学信息注释数据库David 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）及函数绘图软件Origin 9（https：//www.originlab.com/）。
1.2 青黛活性成分及靶点预测在TCMSP 数据库中以“青黛”为关键词进行检索，获取其拉丁名，检索青黛化合物信息，根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和药物相似性（druglikeness，DL）＞0.18两个生物活性指标筛选出符合条件的有效成分。并在TCMSP 数据库Related Targets 中检索青黛全部活性靶点，筛选出与上述有效成分相关的靶点，将这些靶点蛋白名称导入UniProt数据库，将靶点蛋白全称转换成相对应靶基因简称，整合靶基因，删除数据库不存在的基因，最终得到青黛有效成分靶点。
1.3 疾病靶点预测以UC 的英文名“ulcerative colitis”为检索关键词在Gene Cards 数据库中找出UC的相关基因。
1.4 药物对疾病潜在靶点预测和调控网络图在R 软件中找出青黛活性成分的靶点与溃疡性结肠炎相关基因两者的交集并绘制出Venn 图，初步预测青黛治疗UC 潜在作用靶点。再将药物有效成分及作用靶点和疾病的相关基因等导入Cytoscape 3.7.2 软件，得出药物-成分-疾病-靶基因思维关系图并将其关系进行可视化。
1.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）的构建运用String 软件将药物靶点与疾病基因相交集的蛋白基因进行蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）构建，并找出核心基因。
1.6 基因本体论及基因和基因组的京都百科全书分析将“青黛”有效作用于疾病的靶点上传至David 6.8数据库，以Homo spapiens为研究对象，选 择Gene-Ontology（3 selected）和Pathways（3 selected）条目，设置P值（P＜0.01），进行基因本体论功能富集（gene ontology，GO）分类分析了解靶点的主要作用过程以及KEGG 富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，观察靶点在通路中的分布情况。将结果导入Origin 9 画图软件中绘制出相关的生物学过程及信号通路图。
2.1 药物活性成分以“青黛”为关键词从TCMSP共检索出29个活性化合物，以OB＞30%，DL＞0.18为标准，共筛选出9个活性有效成分及其参数信息。其中靛蓝二聚体和靛甙没有有效靶点对应。见表1。
表1 青黛有效活性成分基本信息
2.2 青黛调控UC网络图利用UniProt数据库对TCMSP 获得的100 个靶蛋白全称进行简称转换后获 得48 个靶基因，结合Gene Cards 找出UC 的4209个相关基因，两者取交集后共得到31个共同靶基因。利用Cytoscape 软件构建中药化合物-疾病靶点相互作用网络，结果显示该网络共有38个节点（7 个化合物节点，31 个靶点节点），疾病1个，31个共同靶基因，边85条，有对应靶标的化合物7 个（分别为靛玉红、靛蓝、异靛蓝、异牡荆素、β-谷甾醇、吲哚类及喹啉类化合物）其中靛玉红和β-谷甾醇作用靶点最多，分别为17个和12个。见图1。
图1 药物-靶点-疾病-基因网络
2.3 PPI 网络及关键靶点在STRING 数据平台上输入31个共同靶点，导出PPI蛋白互作网络图，图中含有30 个靶蛋白和150 组互作边，其中PRSS1 是游离蛋白，故将其删除。其中节点代表一个蛋白，两蛋白之间用边相连，边的度值由蓝色变黄色逐渐变小，边越粗表示核心地位越大。其中排名前5 的蛋白分子为JUN（转录因子AP-1）、CASP3（半胱天冬酶3）、CASP8（半胱天冬酶8），PTGS2（人前列腺素G/H合成酶2）、RELA（转录因子p65）。度值越大的蛋白质在整个网络中起关键作用，同时也是青黛治疗UC的关键靶点，见图2—3。
图2 青黛治疗UC相关靶点的PPI网络
图3 青黛治疗UC关键靶点
2.4 GO 富集分析GO 富集分类分析获得条目共84 条，其中生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）条目分别为66、5、13 条。生物过程主要包括细胞对有毒物质的反应、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、对有机物的反应等；
细胞组成主要包括胞质、高尔基体、核等；
分子功能主要包括血红素结合、转录因子活性、sequence-specific DNA结合等。将前10位生物过程结果导入Origin 9画图软件，根据P值（P＜0.01）和基因富集数目的多少绘图，见图4。
图4 青黛治疗UC的GO富集分析BP图（前10位）
2.5 KEGG 通路分析KEGG通路富集分析得到93条通路（P＜0.01）。其中与炎症反应和免疫应答相关的信号通路有白细胞介素17(interleukin-17，IL-17)信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路、Toll 样受体(Toll like receptor，TLRs)信号通路等，体现青黛治疗UC 的多通路特点，部分通路见表2和图5。
图5 青黛治疗UC的KEGG通路分析气泡图
表2 青黛治疗UC的KEGG通路分析
现代药理学研究发现，青黛具有类皮质激素样作用，能抑制平滑肌，降低毛细血管通透性，调节机体免疫功能，具有抗菌，抗病毒和抗肿瘤作用［12］，主要治疗UC、银屑病和白血病3 类疾病［13］。本研究发现青黛包含多种有效成分，可作用于UC多个相关靶点及代谢通路，有减少炎症细胞浸润，保护肠黏膜作用。
3.1 有效成分与靶点蛋白经检索TCMSP 和网络构图分析结果显示，青黛有对应靶点的前5 个活性成分是靛玉红、β-谷甾醇、异牡荆素、氧代吲哚啉类及靛蓝对应靶点分别为17、12、5、5、4 个，体现青黛治疗UC 多成分和多靶点特性。刘丽娟等［14］研究发现靛蓝可下调体内IL-6 水平，发挥对UC 的体外抗炎作用。李楠等［15］研究靛玉红对实验性UC 大鼠的作用机制，结果显示靛玉红可提高结肠中ITF mRNA 表达，降低转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)水平，达到抑制UC 炎症的效果。DING KANG 等［16］实验发现β-谷甾醇能增加小鼠肠上皮细胞抗菌肽的表达，减少鼠型伤寒沙门氏菌的生存，减少白细胞和凋亡因子的浸润，保护肠道屏障功能［17］。经PPI关键靶点分析，青黛作用于UC 的关键靶点可能是JUN、CASP3、PTGS2、CASP8、RELA 等。相关文献报道，JUN 是AP-1（由c-Jun 和c-Fos 构成）单位之一，AP-1是位于JNK下游的关键信号蛋白分子，而AP-1 高频出现在炎症信号通路上，JNK 通路受上游刺激后，被磷酸化激活，进而激活JUN，使炎症启动并增强其转录［18］，此外c-Jun 的高表达可能参与UC 的发展［19］。CASP 家族以无活性酶原存在于细胞质中，接受各种细胞凋亡的信号后激活CASP 系列蛋白分子，使其裂解细胞生存的蛋白，参与细胞凋亡和组织损伤过程［20］，CASP3 与UC 上皮细胞凋亡关系密切［21］。PTGS2 也称为COX-2，是一种合成前列腺素和炎症反应的有效酶，参与人体炎症反应，是治疗UC 的重要靶点［22］。相关文献结果与本研究分析的青黛活性成分与靶点蛋白的作用结果相一致，青黛能减少相关炎症蛋白分子对肠黏膜的破坏，改善胃肠道功能，对UC 产生治疗效果。
3.2 富集与通路分析GO 分类分析结果显示，青黛有效成分分布在细胞质和细胞核中，主要通过对有毒物质的反应和信号转导等生物过程及转录因子活性和DNA结合等分子功能来发挥对UC的防治作用。KEGG 通路分析结果显示，青黛能影响不同通路，其中IL-17信号通路、TLRs信号通路和PI3K/Akt 信号通路与UC 联系密切［23-25］。DEJEA 等研究发现IL-17 信号通路与炎症肠病相关［26］，施沛青等［27］实验表明IL-17 具有强大的促炎活性，通过环氧合酶2(cyclooxygenase，COX-2)诱导炎症细胞释放，并可以同肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和干扰素γ(interferonγ，IFN-γ)蛋白分子发挥协同作用，放大炎症反应，促进UC 发展。TLRs 信号通路是天然免疫系统中的细胞跨膜受体［28］，TLRs 与接头蛋白结合激活核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)进入核内，并激活各种炎症因子转录，增加树突状T 淋巴细胞的活性，介导肠道黏膜免疫反应［29］，增强肠道黏膜损伤，是UC 患者活动期临床症状加重的重要因素［30］。PI3K/Akt 信号通路在细胞增殖分化和凋亡中发挥重要作用，与UC 发生关系密切［31-32］，PI3K/Akt 信号通路被激活后，具有活性的Akt 会促使NF-κB 的激活，NF-κB 激活后可增强促炎因子和白细胞介素的转录，从而引起一系列炎症反应和黏膜损伤，促进UC的发生和发展［33］。
本研究以青黛7 种有效成分为研究对象，探索青黛的靶点和通路，结果显示青黛活性成分可能通过作用于CASP3、PTGS2、JUN 等靶点来阻断IL-17 炎症反应通路及TLRs 信号通路的形成，减少对肠道黏膜屏障的破坏，调节机体免疫，发挥对UC 的治疗作用。但本研究尚有不足之处：缺乏实验室验证；
青黛来源不同，活性成分也有差别；
网络信息更新不及时，数据滞后，给网络药理学研究带来局限性。