肖 潇 刘艳霞 危一飞 邢 玉 滕秀香
(1 北京中医药大学第二临床医学院，北京，100078；
2 首都医科大学附属北京中医医院妇科，北京，100010；
3 北京中医药大学东方医院妇科，北京，100078；
4 中国中医科学院望京医院骨科，北京，100102)
卵巢储备功能减退是指卵巢内卵母细胞数量减少和(或)质量下降，其临床表现为月经稀发或频发，以及闭经，甚至卵巢早衰导致生育能力丧失[1-2]。卵巢储备功能下降可导致卵泡发育异常[3]。研究发现卵巢颗粒细胞参与调节卵泡的发育和生长，对卵泡发育至关重要，颗粒细胞凋亡增加是导致卵泡发育异常及卵巢功能降低的关键因素之一[4-6]。已有大量研究证实雷公藤的生殖毒性可引起卵巢功能减退[7-8]。近年来中药治疗卵巢功能减退的临床疗效被大量报道，中药单体及复方抑制雷公藤多苷所诱导的卵巢颗粒细胞凋亡，改善卵巢储备功能的实验研究亦被学者验证[9-14]。益肾疏肝汤被证实对卵巢储备功能减退以及卵巢早衰等具有显著的临床效果[15-17]。但其作用机制仍不清楚，本研究将通过体外培养大鼠卵巢颗粒细胞，探究益肾疏肝汤对雷公藤多苷诱导的卵巢颗粒细胞凋亡的影响，并深入探究其可能的作用机制，以期为临床上治疗卵巢功能减退相关疾病提供参考依据。
1.1 材料
1.1.1 动物 取26只雌性健康的SD大鼠，日龄22～25 d，体质量50～66 g，购自于斯贝福(北京)生物技术有限公司；
生产许可证：SCXK(京)2019-0010。所有大鼠均饲养在动物房中，适应性饲养1周后进行后续实验。本实验涉及的动物实验已由北京隆安实验动物中心动物伦理委员会审查批准(伦理审批号：BJlongan-L-L-0007)。
1.1.2 药物 益肾疏肝汤是由女贞子15 g、熟地黄10 g、墨旱莲15 g、北沙参20 g、石斛10 g、川续断15 g、桑寄生15 g、菟丝子15 g、酒白芍10 g、月季花6 g、柴胡5 g、白梅花10 g、丹参10 g、桃仁10 g、瞿麦6 g、葛根6 g、甘草6 g组成，由首都医科大学附属北京中医医院提供，最终大鼠用药生药粉剂量为16.38 g/kg/d。戊酸雌二醇(上海源叶生物科技有限公司，货号：S52227-1 g)，雷公藤多苷片(上海复旦复华药业有限公司，国药准字Z31020415)。
1.1.3 试剂与仪器 水合氯醛(上海易恩化学技术有限公司，货号：R008072-500 g)，孕马血清促性腺激素(PMSG)(北京索莱宝科技有限公司，货号：P9970)，Hank′s溶液(北京百奥莱博科技有限公司，货号：SNM237)，DMEM/F12培养基(广州亿宁生物技术有限公司，货号：10-092-CV)，胎牛血清(北京杰辉博高生物技术有限公司，货号：A15-101)，细胞计数法(CCK-8)试剂盒(上海爱必信生物科技有限公司，货号：abs50003)，TUNEL试剂盒(上海泽叶生物科技有限公司，货号：ZY81026)，裂解胱天蛋白酶-3(cl-caspase-3)(Abcam公司，英国，货号：ab4051)，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)抗体(Abcam公司，英国，货号：ab32028)，磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)(Abcam公司，英国，货号：ab40776)，B细胞淋巴瘤-2(B Cell Lymphoma 2,Bcl-2)/白血病-2抗体[Santa Cruz(SCBT)公司，美国，货号：Sc-492]；
Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)抗体(PROTEINTECH GROUP，美国，货号：50599-2-IG)，AKT抗体(CST公司，美国，货号：9272s)，内参GAPDH抗体(杭州贤至生物科技有限公司，货号：AB-P-R 001)，SpectraMax iD3多功能酶标仪(中国上海美谷分子仪器有限公司，型号：SpectraMax iD3)，LW200ET-A生物显微镜(中国上海尖端光电科技有限公司，型号：LW200ET-A)。
1.2 方法
1.2.1 分组与含药血清制备
1.2.1.1 大鼠卵巢颗粒细胞的制备 取6只雌性健康的SD大鼠，在适应性饲养1周后，每只大鼠腹腔注射50 IU的马绒毛膜促性腺激素(曾称孕马血清促性腺激素)，注射48 h后，腹腔注射10%的水合氯醛进行麻醉，然后将大鼠脱颈处死，然后剖腹在无菌条件下取出双侧卵巢，使用预冷的Hank′s溶液将卵巢周围脂肪和包膜等清洗干净，然后将卵巢移入无血清的培养基中，然后刺破卵巢，并使颗粒细胞充分释放出来，然后加入2.5%的胰酶(0.3 mL)反复吹打使得颗粒细胞团块离散，然后在37 ℃条件下使用胰蛋白酶消化10 min，之后加入含有10%的胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，静置10 min后进行离心10 min(1 000 r/min，离心半径10 cm)，弃上清液。加入0.2 mL 10%的胎牛血清制备悬液，并接种于96孔板中(接种密度为5×105/孔)，并在培养箱中进行培养，待细胞融合至80%～85%时进行后续实验。
1.2.1.2 含药血清的制备 取20只雌性健康的SD大鼠，适应性饲养1周后，将大鼠分为3组：雷公藤含药血清组(n=8)、益肾疏肝汤含药血清组(n=8)和雌二醇含药血清组(n=4)；
雷公藤含药血清组给予雷公藤多苷灌胃80 mg/(kg·d)[18]，益肾疏肝汤含药血清组给予益肾疏肝汤灌胃16.38 g/(kg·d)，雌二醇含药血清组给予戊酸雌二醇灌胃0.009 mg/(kg·d)，灌胃1次/d，连续7 d，在第7天灌胃2 h后，心脏采血并分离血清，-20 ℃冰箱保存备用。
1.2.1.3 细胞分组 将细胞分为正常组(正常培养的细胞)、损伤组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、阳性对照组。正常组加入60%空白血清100 μL，损伤组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、阳性对照组先加入含60%雷公藤多苷含药血清各100 μL，培养箱中培养48 h，吸取上清液，于中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组中分别加入20%、40%、60%的益肾疏肝汤含药血清100 μL处理细胞，阳性对照组使用100 μL的雌二醇含药血清处理细胞培养48 h，取培养细胞用于各项指标的检测。
1.2.2 干预方法 将细胞接种于96孔板，细胞贴壁后，弃除培养液，分别加入等量的0、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%的益肾疏肝汤含药血清，并添加无血清培养基直至100 μL，继续培养48 h后采用CCK-8法检测细胞存活率；
同样方法将细胞接种于96孔板，细胞贴壁后，弃除培养液，使用不同浓度(0、20%、40%、60%、80%、100%)的雷公藤多苷含药血清处理细胞48 h后，使用CCK-8法检测细胞存活率。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 CCK-8法检测细胞增殖 将细胞接种于96孔板中(接种密度为5×105/孔)，待细胞贴壁后按照1.2.2中的处理方法将不同浓度的益肾疏肝汤含药血清和雷公藤多苷血清处理细胞，继续培养48 h后，每孔加入100 μL的CCK-8试剂，并在37 ℃下继续培养2 h后，在波长为450 nm处使用酶标仪检测吸光值(OD值)，并计算细胞存活率。并将接种于96孔板后的细胞按照1.2.2中的药物处理分为5组：正常组、损伤组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、阳性对照组，药物处理后，分别在培养24 h、48 h和72 h时，每孔加入100 μL的CCK-8试剂，并在37 ℃下继续培养2 h后，在波长为450 nm处使用酶标仪检测OD值。
1.2.3.2 TUNEL法检测各组细胞凋亡 采用一步脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)检测卵巢颗粒细胞凋亡。将卵巢颗粒细胞以1×104/孔的密度接种于48孔板上，继续培养24 h，按照前面所述方法分组处理后，使用4%的多聚甲醛固定细胞，0.3%的Triton X-100渗透细胞。然后按照制试剂盒操作流程，使用TUNEL反应缓冲液在37 ℃遮光孵育60 min。使用荧光显微镜观察凋亡细胞。
1.2.3.3 蛋白印迹法检测各组细胞相关蛋白表达 收集各组细胞，使用放射免疫沉淀法裂解液裂解细胞后，提取各组细胞的总蛋白，使用BCA法对蛋白进行定量，然后取50 μg蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞，结束后转至NC膜，并浸泡在5%的脱脂奶粉中进行室温封闭2 h，结束后加入稀释的一抗试剂(稀释浓度均为1∶1 000)，在4 ℃冰箱里结合过夜，第2天加入二抗试剂(稀释浓度：1∶4 000)，室温条件下结合2 h后滴加ECL发光显色液，曝光并进行灰度值分析。
2.1 不同浓度的益肾疏肝汤对卵巢颗粒细胞存活率的影响 与0%益肾疏肝汤组比较，其他剂量的益肾疏肝汤处理细胞后，5%、10%、80%、100%的益肾疏肝汤对细胞具有显著影响(P<0.05)，而20%、0%、60%的益肾疏肝汤对细胞无明显影响(P>0.05)。因此后续实验益肾疏肝汤的中、低、高剂量分别选为20%、40%、60%。见表1。
表1 不同浓度的益肾疏肝汤对卵巢颗粒细胞存活率的影响(%，n=6)
2.2 不同浓度的雷公藤多苷对卵巢颗粒细胞存活率的影响 与0%雷公藤多苷组比较，其余剂量的雷公藤多苷处理细胞后，细胞存活率均显著降低(P<0.05)；
当使用60%的雷公藤多苷刺激细胞后，细胞存活率约为50%作用，因此后续实验雷公藤多苷的剂量选择60%。见表2。
表2 不同浓度的雷公藤多苷对卵巢颗粒细胞存活率的影响(%，n=6)
2.3 益肾疏肝汤可扭转雷公藤多苷对卵巢颗粒细胞增殖的抑制 与正常组比较，损伤组细胞24、48、72 h的OD值均显著降低(P<0.05)；
与损伤组比较，中药低、中药中剂量组、中药高剂量组在48、72 h的OD值均显著增加(P<0.05)；
同时中药低、中药中剂量组、中药高剂量组之间在48、72 h的OD值差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3。
表3 各组细胞不同时间点OD值的比较
2.4 益肾疏肝汤对雷公藤多苷诱导的卵巢颗粒细胞凋亡的影响 与正常组比较，损伤组TUNEL阳性细胞率、Bax和cl-caspase-3蛋白表达水平均显著增加(均P<0.05)，而Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)；
与损伤组比较，阳性对照组以及中药低、中药中剂量组、中药高剂量组的TUNEL阳性细胞率、Bax和cl-caspase-3蛋白表达水平均显著增降低(均P<0.05)，而Bcl-2蛋白水平显著上升(P<0.05)；
且各指标在中药低、中药中剂量组、中药高剂量组之间的差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图1～2和表4。
表4 各组TUNEL阳性细胞率及凋亡相关蛋白表达水平比较
图1 TUNEL法检测各组细胞凋亡情况
图2 蛋白质印迹法检测各组细胞凋亡相关蛋白表达情况
2.5 益肾疏肝汤对卵巢颗粒细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响 与正常组比较，损伤组细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)；
与损伤组比较，阳性对照组以及中药低、中药中剂量组、中药高剂量组的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平均显著增加(P<0.05)，且呈剂量依赖(P<0.05)。PI3K、AKT、mTOR蛋白水平在各组之间差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图3、表5。
图3 各组细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达情况
表5 各组细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响
卵巢颗粒细胞是卵巢中的主要功能细胞，在卵母细胞的发育中扮演着重要的角色，从原始的卵泡生长启动开始到增殖、分化以及闭锁、排卵以及黄体形成，卵巢颗粒细胞在形态以及功能上均发生了变化[19]。雷公藤多苷是从中药雷公藤根茎中提取的化合物，具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等功效，但对女性而言，可导致卵巢器官的药源性损伤，引起卵巢功能减退[20]。龙旭[18]应用雷公藤多苷含药血清干预大鼠卵巢颗粒细胞后细胞凋亡明显，本研究亦用此造模方法，并筛选出了最适合的药物干预剂量。而近年来，中药治疗雷公藤多苷导致的卵巢颗粒细胞凋亡的作用被证实，陆柳如[21]研究发现补肾活血方可通过加快颗粒细胞的有丝分裂信号转导，加强卵巢颗粒细胞的增殖，促进卵泡的生长，缓解雷公藤多苷导致卵泡发育障碍。益肾疏肝汤是由女贞子、熟地黄、墨旱莲、北沙参、甘草、丹参等配伍的中药方剂，具有通行血脉，清血分之热及活血调经，改善卵巢功能的功效。然而益肾疏肝汤对改善卵巢功能的作用机制还不清楚，本研究发现益肾疏肝汤可调节大鼠卵巢颗粒细胞的存活率，这提示益肾疏肝汤可能通过调节卵巢颗粒细胞改善卵巢功能。使用雷公藤多苷刺激细胞后，细胞的存活率显著降低，而益肾疏肝汤含药血清可显著削弱雷公藤多苷对细胞增殖的抑制作用，表明益肾疏肝汤含药血清可减轻雷公藤多苷对卵巢颗粒细胞的损伤。
卵巢颗粒细胞凋亡是卵泡发育和卵巢功能的重要环节，不正常的卵巢颗粒细胞凋亡影响卵巢的功能，Bax、Caspase-3、Bcl-2是凋亡过程中重要的凋亡调节分子，Caspase-3是卵巢颗粒细胞凋亡的主要信号转导通路，当凋亡发生时线粒体途径介导的Bax表达升高，并引起Caspase的级联反应，进一步诱导凋亡，Bax与Bcl-2可形成二聚体，共同诱导凋亡[22-23]。张双等[24]、严如根等[25]通过实验研究发现补肾类复方可抑制大鼠卵巢颗粒细胞凋亡，改善卵巢功能，其机制可能与调控Bcl-2相关线粒体凋亡信号通路有关。本研究结果显示，雷公藤多苷可显著诱导大鼠卵巢颗粒细胞凋亡，且增加Bax、cl-caspase-3的蛋白表达水平，抑制Bcl-2蛋白的表达，而益肾疏肝汤含药血清可显著降低雷公藤多苷对颗粒细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2表达的调控，且呈剂量依赖性。这提示，益肾疏肝汤含药血清可通过抑制细胞凋亡途径减少雷公藤多苷对大鼠卵巢颗粒细胞的损伤。
进一步探究益肾疏肝汤含药血清调控颗粒细胞的分子作用机制，我们发现益肾疏肝汤含药血清可上调颗粒细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平。研究表明PI3K/AKT信号通路在卵巢颗粒细胞的分化中扮演重要角色，当小鼠卵巢颗粒细胞的AKT1基因被敲除后，颗粒细胞的存活率明显降低，且小鼠卵巢中的卵泡数量明显减少。当PI3K/AKT通路被激活后，PI3K、AKT磷酸化水平增加，进一步激活下游基因mTOR，并发挥着促进细胞增殖的作用[26-27]。研究发现中药复方可提高卵巢颗粒细胞中PI3K、mTOR的表达，抑制AKT表达，从而调节卵泡发育，抑制卵泡闭锁、改善卵巢功能[28-30]。本课题中雷公藤多苷可抑制p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达，而益肾疏肝汤含药血清可显著降低雷公藤多苷对p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达的影响。
综上所述，益肾疏肝汤含药血清可能通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路，调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达，减轻雷公藤多苷对卵巢颗粒细胞凋亡的影响。
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