李 倩，张烨君，李 燃，岳宇坤，娄 展
(河北北方学院附属第一医院神经内三科，河北 张家口 075000)
阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种进展缓慢的神经退行性疾病，为临床最常见的痴呆类型[1]，其特征是细胞外淀粉样斑块、细胞内神经原纤维缠结和神经元死亡[2]。β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)是淀粉样斑块的主要成分，Aβ升高与认知缺陷的严重程度有关[3]。研究表明，激活的小胶质细胞和神经炎症可引起氧化应激和神经元损伤，导致AD患者脑内形成淀粉样斑块和缠结[4]。AD主要依靠药物治疗，对于认知症状采用胆碱酶抑制剂和谷氨酸受体拮抗剂联合治疗，对于精神行为症状采用非典型抗精神病药和5-羟色胺类药[5]。尽管近年来临床在AD的治疗方面取得了很大进展，但疗效并不令人十分满意。因此，开发新的AD治疗药物具有重要意义。中医药作为医学重要组成部分，对于改善AD患者症状具有显著作用[6]。麦冬皂苷D是一种从麦冬中提取出的生物活性甾体苷，具有抗炎、抗氧化、止咳、抑制血栓形成等药理作用[7]，但其能否改善AD患者认知功能障碍目前尚不清楚。因此，本研究探讨麦冬皂苷D对AD模型大鼠认知功能障碍的作用及其机制，以期为临床治疗AD提供参考，现报告如下。
1.1 实验动物与试剂
SPF级Wistar大鼠72只，8周龄，体质量230～250 g，购于河北省实验动物中心，许可证号：SCXK(冀)2018-004。
β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42，美国Sigma公司)，盐酸多奈哌齐片(重庆植恩药业有限公司)，麦冬皂苷D(HPLC≥98%，上海吉至生化科技有限公司)，甲苯胺蓝染色液(北京伊塔生物科技有限公司)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)检测试剂盒(武汉益普生物科技有限公司)，乙酰胆碱转移酶(choline acetyltransferase，ChAT)、乙酰胆碱酯酶(acetyl cholinesterase，AChE)、乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)检测试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司)，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)一抗和二抗(武汉博士德生物工程有限公司)。
1.2 动物模型建立及干预方法
72只大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组、模型组、麦冬皂苷D 10 mg/kg组、麦冬皂苷D 20 mg/kg组、麦冬皂苷D 40 mg/kg组和盐酸多奈哌齐组，每组12只。除假手术组外，其余各组均建立AD大鼠模型[8]。术前禁食12 h，0.3%戊巴比妥钠麻醉后固定于脑立体定位仪上，头顶备皮后从正中作一切口，中线旁开约2 mm、前囟后约3 mm、深3 mm，用微量进液器向海马注射Aβ1-42溶液2 μL(2.5 μg/μL)，速度为1 μL/min，注射完留针3 min防止溢出，缝合切口；
假手术组在头顶切口用微量进液器注射等体积生理盐水，所有大鼠术后均单笼饲养。4 d后采用水迷宫试验判断造模是否成功，与假手术组比较，逃避潜伏期缩短1/3表明造模成功，剔除每组造模失败的大鼠并补充相应数量。造模成功后第2天开始进行药物干预，麦冬皂苷D治疗组分别以10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg麦冬皂苷D溶液灌胃，盐酸多奈哌齐组用盐酸多奈哌齐0.9 mg/kg灌胃，假手术组和模型组大鼠用等体积生理盐水灌胃，每日1次，持续4周。
1.3 水迷宫试验检测大鼠认知能力
干预结束前6 d开始水迷宫试验，第1天为适应性训练，未记录时间，第2～5天将大鼠从同一入水点放入水中，记录逃跑潜伏期，即80 s内大鼠下水后找到并爬上水中平台的时间，若80 s内大鼠未找到平台，则将其引导至平台并记录逃跑潜伏期为80 s；
第6天撤除平台，随机选择入水点将大鼠放入水中，记录80 s内大鼠在原平台所在目标象限停留时间及穿越目标象限次数。
1.4 HE染色检测海马组织病理变化
末次水迷宫试验结束1 h后，每组随机选出6只大鼠，心脏灌注后取脑并剥离海马组织，固定于4%多聚甲醛48 h。将海马组织修剪成组织块并以梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，进行HE染色，显微镜下观察海马组织病理变化。
1.5 尼氏染色检测海马组织尼氏体变化
将石蜡切片脱蜡入水后用甲苯胺蓝染色液染色5 min，蒸馏水洗后用1%冰醋酸分化5 s，经无水乙醇脱水、二甲苯透明5 min，晾干后封片，避光保存，显微镜下观察尼氏体情况。
1.6 氧化应激指标和神经递质水平检测
末次水迷宫试验结束1 h后，将每组剩余6只大鼠断头取脑，冰上分离海马组织，保存于-80 ℃冰箱。将海马组织手动匀浆并稀释，按照试剂盒说明书检测海马组织中氧化应激指标MDA、SOD、GSH-Px和神经递质ChAT、Ach、AChE水平。
1.7 Western blot检测蛋白表达水平
将海马组织手动匀浆、裂解并提取总蛋白进行蛋白定量，用分离胶与浓缩胶制备电泳，上样并电泳(80 V、30 min，110 V至marker接近底部1 cm左右)、转膜(220 V、90 min)，以5%脱脂牛奶4 ℃封闭2 h，洗膜3次，一抗(1∶800)稀释液中4 ℃振荡孵育过夜，洗膜3次，二抗(1∶2 000)稀释液中室温孵育2 h，ECL显色并用凝胶成像系统成像，Image J软件分析条带灰度值。
1.8 统计学方法
2.1 麦冬皂苷D对大鼠认知能力的影响
与假手术组比较，模型组大鼠逃跑潜伏期均延长(P<0.05)，穿越目标象限次数减少(P<0.05)，在目标象限停留时间缩短(P<0.05)；
与模型组比较，麦冬皂苷D 20 mg/kg组、40 mg/kg组和盐酸多奈哌齐组大鼠逃跑潜伏期均缩短(P<0.05)，穿越目标象限次数增加(P<0.05)，在目标象限停留时间延长(P<0.05)，见图1。
a：大鼠逃跑潜伏期；
b：大鼠穿越目标象限次数；
c：大鼠目标象限停留时间 1：假手术组；
2：模型组；
3：麦冬皂苷D 10 mg/kg组；
4：麦冬皂苷D 20 mg/kg组；
5：麦冬皂苷D 40 mg/kg组；
6：盐酸多奈哌齐组；
*：与假手术组比较，P<0.05；
#：与模型组比较，P<0.05
2.2 麦冬皂苷D对大鼠海马组织病理变化的影响
假手术组海马神经元无明显异常，模型组较假手术组出现明显神经元排列紊乱和海马组织空洞增多，与模型组比较，麦冬皂苷D 20 mg/kg组、40 mg/kg组和盐酸多奈哌齐组上述情况均出现不同程度的改善，见图2。
图2 大鼠海马组织HE染色
2.3 麦冬皂苷D对大鼠海马组织尼氏体的影响
显微镜下假手术组大鼠海马神经元排列规则，尼氏体数量较多；
模型组和麦冬皂苷D 10 mg/kg组大鼠海马神经元排列不规则，尼氏体数量较少；
麦冬皂苷D 20 mg/kg组、40 mg/kg组和盐酸多奈哌齐组海马神经元排列整齐且尼氏体数量较模型组明显增多，见图3。
图3 大鼠海马组织尼氏染色
2.4 麦冬皂苷D对大鼠氧化应激的影响
与假手术组比较，模型组大鼠海马组织MDA水平升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px水平降低(P<0.05)；
与模型组比较，麦冬皂苷D 20 mg/kg组、40 mg/kg组和盐酸多奈哌齐组大鼠海马组织MDA水平降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px水平升高(P<0.05)，见图4。
a：大鼠海马组织MDA水平；
b：大鼠海马组织SOD水平；
c：大鼠海马组织GSH-Px水平 1：假手术组；
2：模型组；
3：麦冬皂苷D 10 mg/kg组；
4：麦冬皂苷D 20 mg/kg组；
5：麦冬皂苷D 40 mg/kg组；
6：盐酸多奈哌齐组；
*：与假手术组比较，P<0.05；
#：与模型组比较，P<0.05
2.5 麦冬皂苷D对大鼠胆碱能神经递质的影响
与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中ChAT、Ach水平降低(P<0.05)，AChE水平升高(P<0.05)；
与模型组比较，麦冬皂苷D 20 mg/kg组、40 mg/kg组和盐酸多奈哌齐组大鼠海马组织中ChAT、Ach水平升高(P<0.05)，AChE水平降低(P<0.05)，见图5。
a：大鼠海马组织ChAT水平；
b：大鼠海马组织Ach水平；
c：大鼠海马组织AChE水平 1：假手术组；
2：模型组；
3：麦冬皂苷D 10 mg/kg组；
4：麦冬皂苷D 20 mg/kg组；
5：麦冬皂苷D 40 mg/kg组；
6：盐酸多奈哌齐组；
*：与假手术组比较，P<0.05；
#：与模型组比较，P<0.05
2.6 麦冬皂苷D对大鼠BDNF/TrkB信号通路的影响
与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中BDNF、TrkB蛋白表达水平均下调(P<0.05)；
与模型组比较，麦冬皂苷D 20 mg/kg组、40 mg/kg组和盐酸多奈哌齐组大鼠海马组织中BDNF、TrkB蛋白表达水平均上调(P<0.05)，见图6。
a：Western blot蛋白表达条带；
b：蛋白相对表达水平 1:假手术组；
2:模型组；
3：麦冬皂苷D 10 mg/kg组；
4：麦冬皂苷D 20 mg/kg组；
5：麦冬皂苷D 40 mg/kg组；
6：盐酸多奈哌齐组；
*：与假手术组比较，P<0.05；
#：与模型组比较，P<0.05
临床上常用的AD疗法仅能够轻微缓解症状，对疾病进展的延缓作用微乎其微，且AD进展到出现认知功能障碍后神经元损伤已不可逆转，故当前的研究普遍集中于AD的早期检测和治疗干预[9-10]。麦冬皂苷D因具有抗肿瘤、抗氧化、减轻代谢综合征、改善肠道菌群等广泛的药理作用而受到越来越多的关注[11-13]，但对中枢神经系统的作用却鲜少报道。尼氏体是神经元的特征性结构，由粗面内质网和游离核糖体组成，神经元损伤会导致尼氏体溶解[14]，其形态和数量反映了神经元功能状态。本研究结果显示，经麦冬皂苷D干预后，AD大鼠逃跑潜伏期逐渐缩短，穿越目标象限次数增加，在目标象限停留时间延长，且海马神经元形态和排列得到改善，尼氏体数量增加，与刘江华等[15]的研究结果相似，表明麦冬皂苷D对AD大鼠认知功能障碍和神经元功能具有改善作用。
氧化应激发生在AD早期，在AD的发生发展中起关键作用。有轻微认知功能障碍的患者在发展为AD之前已被确定有氧化损伤，海马组织中蛋白、脂质和核酸的氧化产物水平与Aβ1-40和Aβ1-42水平升高有关，而Aβ水平较低的区域，氧化应激指标水平也较低[16-17]。Ach是胆碱能神经元的信号递质。Liu等[18]认为约90%的AD患者在神经冲动传递过程中缺乏Ach。ChAT、AChE活性的变化是间接反映AD胆碱能生化变化的重要指标，通过抑制突触AChE促进突触间隙中Ach降解，也是多种AD药物的作用机制[19-20]。据报道，麦冬皂苷D可通过抑制PI3K/Akt信号通路，减轻肺泡上皮细胞氧化应激损伤[21]。本研究检测了AD大鼠海马组织氧化应激指标和胆碱能神经递质，结果显示，麦冬皂苷D可降低MDA和AChE水平，提升SOD、GSH-Px和ChAT、Ach水平，与赵玲琳等[22]报道的麦冬皂苷D能减轻心肌细胞氧化应激的作用相似，但目前鲜见麦冬皂苷D调节神经递质平衡的相关报道。本研究发现麦冬皂苷D可有效减轻AD大鼠氧化应激，调节神经递质平衡。
虽然我们明确了麦冬皂苷D可改善AD大鼠认知功能障碍，但其作用机制尚不明确。BDNF/TrkB信号通路在AD认知功能障碍过程中具有重要作用[23]，BDNF广泛分布于中枢神经系统，可抑制Aβ诱导的神经元凋亡，通过与其特异性受体TrkB结合，激活下游信号通路，参与神经元生长和分化等过程[24-25]。Ng等[26]研究表明，AD患者与健康对照组比较，血清BDNF水平显著降低。本研究检测了AD大鼠海马组织BDNF/TrkB信号通路蛋白表达水平，结果显示，AD大鼠海马组织中BDNF、TrkB蛋白表达水平降低，而经麦冬皂苷D干预后，AD大鼠海马组织中BDNF、TrkB蛋白表达水平上调，表明麦冬皂苷D对AD的改善作用可能与调控BDNF/TrkB信号通路相关。
综上所述，麦冬皂苷D可改善AD大鼠认知功能障碍，可能与减轻氧化应激，调节神经递质平衡，调控BDNF/TrkB信号通路相关。然而由于中药活性成分的药理作用大多具有多靶点、多通路的特点，麦冬皂苷D是否可通过其他途径改善AD认知功能障碍尚未可知，未来将开展进一步研究。
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