马燕华 何 旎 裴少非 吕 典 李文君 樊保敏 曾广智 林成源
(云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，昆明 650500)
甘丙肽受体2(Galanin receptor 2, GalR2)广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统的各个器官组织，是神经肽甘丙肽(Galanin)和Spexin的共同受体之一。Galanin和Spexin是同属于Gal/Kiss肽家族的小分子神经肽，是机体内调控多种生理变化和疾病发展的重要激素，两者均能够通过G蛋白偶联受体GalR2介导多种重要的生理病理调节作用，如肥胖症[1]、2型糖尿病[2]、阿尔茨海默病[3]、抑郁症[3-4]、炎症性疼痛[5]、胃肠道功能调节[6]等。这些疾病的发病原因十分复杂，GalR2在这些疾病发生的病理过程中发挥的影响机制尚未清楚，因此，对于GalR2基因编码的蛋白受体在人类健康和疾病治疗中的影响机制亟待探索。随着基因编辑技术的完善度与精确性的不断提高，第三代基因编辑技术CRISPR-Cas9应运而生。GalR2基因敲除模型可以从整体水平上研究该偶联蛋白受体在机体内的功能，因此，本文针对引进的小鼠的饲养繁育与基因型鉴定，筛选出GalR2基因敲除小鼠，对其生长发育和相关的疾病研究具有重要作用。
1.1 实验动物
GalR2基因敲除小鼠通过CRISPR-Cas9基因编辑技术制备而得，由赛业模式生物研究中心(太仓)有限公司引进，2雄3雌，遗传背景为C57BL/6N小鼠，基因型均为杂合子(GalR2+/-)。
1.2 主要试剂与仪器
蛋白酶K(产品编号：3022765，Merck公司)；
琼脂糖Agarose G-10(产品编号：162135，Biowest公司)；
GelRed核酸染料(产品编号：41003，Biotium公司)；
Premix Taq (产品编号：RR901A，TaKaRa公司)；
GeneRuler DNA Ladder(产品编号：00593738，Thermo Scientific公司)；
DNA上样缓冲液(产品编号：6601783，Biosharp公司)。
MAST-A型脉动真空灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)；
5424R型离心机(Eppendorf公司)；
THZ-100B型恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)；
DRY BLOCK HEATER金属浴(IKA集团)；
FlexCycler2多功能PCR仪(耶拿分析仪器股份公司)；
JY600型电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；
SC805型全自动凝胶成像系统(苏州百拓生物技术服务有限公司);SPF小鼠维持饲料和SPF玉米芯垫料(北京科奥协力饲料有限公司)。
1.3 小鼠的饲养和繁殖
所有繁育的小鼠饲养于SPF级动物设施中，实验动物使用许可证号SYXK(滇)K2017-0001。室内温度控制在22～26 ℃，湿度50%～60%，光照明暗控制各为12 h，小鼠笼盒、玉米芯垫料以及饮用水均经过高温、高压灭菌处理。饲养过程中，每天进入动物设施1次，添加饲料和水并观察小鼠的生长情况，玉米芯垫料每周更换1次，体质量每两周记录1次。
小鼠的繁殖方式为将性成熟的小鼠(6～8周龄)以雄雌1∶2的比例于IVC笼同笼合养。繁殖方法为杂合子×杂合子，野生型×杂合子。雌鼠的妊娠期为12～25 d。
1.4 小鼠的基因型鉴定
因引进的GalR2基因敲除小鼠基因型为杂合子，根据孟德尔经典遗传学，繁育获得的子代，其基因型可能为纯合子(GalR2-/-, Homozygotes, Ho)、杂合子(GalR2+/-, Heterozygotes, He)及野生型(GalR2+/+, Wild-type, WT)。
1.4.1小鼠组织DNA的提取：将小鼠固定，剪取2～5 mm鼠尾，置于离心管中并加入100 μL尾消化缓冲液和1 μL蛋白酶K(终浓度0.5 mg/mL)，置于56 ℃，190 r/min摇床过夜；
次日将其置于98 ℃金属浴13 min使蛋白酶K变性，并于25 ℃，14 000 r/min离心15 min，取上清液，获得粗提DNA，于-20 ℃保存。
1.4.2聚合酶链式反应(PCR)：PCR反应引物由擎科生物技术有限公司昆明合成部合成，引物序列见表1。PCR扩增体系为25 μL，即在普通PCR八连排管中分别加入 9.0 μL ddH2O、1.0 μL Product Primer F、1.0 μL Product Primer R、12.5 μL Premix Taq和1.5 μL 小鼠鼠尾DNA。以94 ℃预变性3 min、 94 ℃变性30 s、60 ℃退火35 s、72 ℃延伸35 s，循环35次，再以72 ℃进行2次延伸5 min为PCR扩增条件对小鼠GalR2基因进行扩增。
表1 PCR扩增引物序列Table 1 Sequences of the primers used for PCR analyses
1.4.3琼脂糖凝胶电泳及基因型鉴定：使用GelRed预制胶法配制0.5%琼脂糖凝胶，取PCR产物5 μL和Marker 1 μL于加样孔中进行电泳分析，加样完毕后，设定电压为120 V，电泳时间为30 min，肉眼可见溴酚蓝泳至距制胶板前端2～3 cm处即可停止电泳。切断电源，取出凝胶，用全自动凝胶成像系统观察电泳结果并拍照保存。
由引物F1和R1扩增而得的DNA条带位于416 bp，为纯合子小鼠Ho；
由引物F2和R1扩增而得的DNA产物条带位于609 bp，为野生型小鼠WT；
两个DNA产物条带均存在，为杂合子小鼠He。
1.5 统计学方法
2.1 小鼠繁殖及生长情况
从苏州引进的种鼠成功繁育子代，每只母鼠孕期20～23 d，哺乳期18～25 d，产仔数6～12只，成活率大于96%。目前已稳定繁殖至F3代，具体的繁殖情况如表2所示。有小部分小鼠在出生3～6周时其后背部会出现脱毛现象(并非由于同伴互相舔舐造成的脱毛)，但未出现其他异常情况。如若一窝幼鼠为10～12只时，会出现1～2只幼鼠因无法获得哺乳而体型过小致死，同时，让其他母鼠代乳会出现食子现象。
表2 F1-F3代小鼠繁殖情况(只)Table 2 Reproduction of F1-F3 generation mice(n)
2.2 小鼠基因型鉴定结果
对引进的5只小鼠进行基因型检测。电泳条带位于416 bp和609 bp有较亮的荧光为杂合子He，电泳条带位于609 bp为野生型WT(图1)，与该公司提供的鉴定报告一致。
图1 引进的GalR2基因敲除小鼠基因型鉴定Fig.1 Identification of imported GalR2 gene knockout mice
对繁殖获得的小鼠进行基因型检测。DNA条带位于416 bp处为纯合子Ho，电泳条带位于416 bp和609 bp为杂合子He，电泳条带位于609 bp为野生型WT。在100 bp中比较亮的条带是样品中出现引物二聚体引起的(图2)。
图2 子代GalR2基因敲除小鼠基因型鉴定Fig.2 Identification of GalR2 gene knockout in offspring mice
2.3 基因敲除小鼠繁育结果
将引进的GalR2基因敲除杂合子雄鼠和野生型雌鼠以1∶2的比例，或杂合子雌鼠和野生型雄鼠以2∶1的比例进行交配繁殖，获得的F1代杂合子小鼠进行同胞交配，获得F2代纯合子、杂合子和野生型小鼠。F2代子代之间进行同笼交配繁殖获得F3代，繁殖方式同F1代(图3)。
图3 GalR2基因敲除小鼠基因型繁殖策略Fig.3 Strategy of breeding of GalR2 gene knockout mice
2.4 小鼠体质量变化
经观察(图4)，三种基因型的雌鼠体型从离乳开始就可以明显看到差异，明显小于同周龄雄鼠，并随着年龄的增长逐渐拉开差距，与鉴定IG结果一致。
注：A. 雄鼠; B. 雌鼠Note：A. Male mice; B. Female mice图4 GalR2基因敲除小鼠体质量变化趋势图Fig.4 Body weight of GalR2 gene knockout mice
基因敲除小鼠是一种利用新型的分子生物学技术，结合细胞生物学和动物胚胎学的方法，使小鼠体内特定的基因失活或功能缺失的模型，以系统了解哺乳动物的生理和生化过程，并以此生成“人源化”小鼠模型作为新药开发策略的一部分[7]。GalR2是神经肽Galanin和Spexin的共同受体，其表达水平的改变与两类神经肽的表型重塑和疾病的发生发展密切相关。近年来，已有研究者利用反转录病毒诱变方法建立了该模型小鼠并进行了相关的行为学和体内激素分泌研究，对GalR2在人类相关疾病过程的作用和机制研究有了进一步的认识[8-11]。但与之不同的一点是，本研究中使用了新近发展起来的CRISPR-Cas9基因编辑技术，此技术在哺乳动物中可实现快速准确定位待编辑的基因，具有简单高效、廉价易用等特点[12]。此外，该项技术已成功运用在神经退行性疾病和遗传性疾病的相关动物模型中[13]，为探索相关疾病的治疗方法具有重要意义，也为研究GalR2在阿尔茨海默病、抑郁症和2型糖尿病等复杂疾病中的作用机制提供了可靠的研究手段。
本次引进的GalR2基因敲除小鼠均为杂合子, 雌雄交配后，其后代可能出现纯合子、杂合子和野生型3种基因型。后期繁育过程中发现GalR2的基因缺失导致GalR2基因敲除小鼠相对于野生型小鼠性情温和，易受惊吓，杂合子和纯合子敲除小鼠均具有生殖能力。小鼠的这种行为表现与其他课题组的研究结果相似[8-11]。但在此篇文章中并未对小鼠的行为学进行进一步的研究或与前人的工作比较，因此，后期还需要对CRISPR-Cas9技术制备而得的基因敲除小鼠进行进一步的探究。此外，为获得更多子代小鼠，必须使用杂合子小鼠进行配种，通过PCR等方法鉴定其子代基因型。GalR2敲除雌鼠的成长发育较雄鼠慢，因此，雄性幼鼠的生长速度与雌鼠相比要快，且成年后雄鼠的体质量增长速率也比GalR2敲除雌鼠和GalR2野生型雄雌小鼠明显增大，17周龄的雄、雌鼠平均体质量分别为21.92 g和30.14 g，17周后，两者的体质量增长速率趋缓；
29周后，雌雄鼠之间的体质量差异越来越大，雄鼠的体质量平均值可达37.33 g，雌鼠的体质量平均值为27.28 g。说明GalR2的缺失在幼鼠的生长发育过程中具有一定的影响，此现象也与此前研究报道中提及的Spexin表达水平与体质量呈负相关研究结果一致[14-15]。
有研究表明，在角叉菜胶致大鼠足肿胀急性炎症模型中，神经元上的GalR1和GalR2在mRNA水平上的表达分别抑制和增加[16-17]；
Spexin在肥胖小鼠模型和临床样本中均发现其具有抗肥胖和抗2型糖尿病的作用；
而且在本课题组的研究中发现，Spexin能通过同时抑制GalR2和GalR3表达调节小鼠胆汁酸和肝中胆固醇7α-羟化酶的表达，表明Spexin在胆汁酸代谢调节中具有重要的作用[18]，但是Galanin和Spexin在这些方面的作用机制是通过GalR1、GalR2或是GalR3尚未可知。因此，GalR2单基因敲除小鼠模型的建立可为有效特异地针对GalR2蛋白相关的疾病研究提供必要条件，并为研究相关疾病靶向药物夯实基础。
目前，暂未有国内其他课题组对GalR2基因敲除小鼠进行研究。本研究中使用的GalR2基因敲除小鼠是国内首次建立的该基因的相关模型动物，也是在国内外首次使用新型基因编辑技术建立的敲除小鼠模型，因此，为深入研究GalR2基因敲除小鼠不同器官、组织和细胞的生理病理过程提供了必要的条件，也为进一步探究相较于使用反转录病毒诱变方法和本研究使用的CRISPR-Cas9技术建立的该模型小鼠在行为学和生理方面有何差异奠定了基础。
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