封腾望, 王新新, 周锐东, 刘 欢, 孙慧武, 李晋成*,
(1. 上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306；
2. 中国水产科学研究院，北京 100141；
3. 农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141)
农药残留可在水产养殖的水产品中富集并通过食物链在人体内蓄积[1]，其安全问题引起关注。为了保证水产品质量安全，我国农业农村部等10 部委于2019 年印发《关于加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》[2]，大力推进水产养殖绿色发展，防控水域污染。因此，探索并建立水产品中农药多残留定量检测方法已经成为研究热点。
2020 年，农业农村部制定了《水产养殖用药明白纸》[3]，明确将克百威等农药列入了水产养殖过程中禁止使用药物清单；
另外，有机磷类农药[4]和三嗪类除草剂[5]同样会在水产品中蓄积并产生危害。目前，以克百威为代表的氨基甲酸酯类农药[6-14]、以乐果和灭线磷为代表的有机磷农药[7-11,14,15]以及三嗪类除草剂[7]在水产品中的残留检测分析已有相关研究报道，但3 种不同类型农药同时检测技术鲜有报道。本研究选取以克百威为代表的8 种氨基甲酸酯类农药、以乐果和灭线磷为代表的2 种有机磷农药以及以扑草净为代表的三嗪类除草剂作为研究对象，以期建立草鱼中3 种不同类型农药残留的检测方法。
目前，水产品中农药多残留的检测方法主要有气相色谱-串联质谱法[16-18]和高效液相色谱-串联质谱法[6,8,19]。虽然水产品中农药多残留的分析方法取得一定进展，但由于水产品基质中干扰物质含量高，导致样品前处理过程复杂。目前，针对水产品中农药的样品前处理方法有固相萃取[20-21]、QuEChERS 方法[8,22-24]等。滤过型净化柱(multi-plug filtration clean-up, m-PFC)由中国农业大学潘灿平[25]课题组开发，与传统样品前处理方法相比，m-PFC 无需活化、淋洗等操作，仅需一步即可实现提取液的快速净化，具有操作简单、处理速度快的优点。该技术已经在水产品中孔雀石绿、结晶紫残留检测中成功应用[26]。然而，m-PFC 在使用过程中需要拔掉活塞才能往柱管中加入待净化液。本课题组基于m-PFC 提出了推杆式滤过型净化柱 (CAFS clean-up column)，该净化柱在柱管上部侧壁设置上样口，仅需将活塞拉至上样口上方即可加入待净化液，并将其结合超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱 (UPLCQTRAP-MS/MS) 构建了鱼肉中三卡因、丁卡因和布比卡因残留量的快速检测方法[27]。基于本课题组自行研制的快速自动化净化仪[28]，实现批量自动净化，大大提高了检测效率。
本研究基于QuEChERS 方法，使用CAFS clean-up column，结合UPLC-QTRAP-MS/MS 建立了草鱼中11 种农药 (结构式见图式1) 残留的快速分析方法，旨在为水产品中农药多残留的快速检测提供参考。
图式1 11 种农药的化学结构式Scheme 1 Chemical structural formulas of 11 pesticides
1.1 药剂、试剂及材料
99.9%扑草净标准品 (德国Dr.Ehrenstorfer 公司)；
甲醇中杀虫剂混标溶液 (包含残杀威、甲硫威、杀线威、速灭威、克百威、甲萘威、异丙威、仲丁威、乐果和灭线磷，质量浓度均为100 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司)。乙腈和甲醇 (HPLC级，美国J.T.Baker 公司)；
甲酸 (色谱级，上海阿拉丁生物科技股份有限公司)；
N-丙基乙二胺(PSA)和十八烷基硅烷键合硅胶(C18) (北京振翔科技有限公司)；
NaCl (分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)。
以乙腈为溶剂，制备扑草净的标准储备液(1.0 mg/mL)并用乙腈稀释制得扑草净标准中间液(100.0、10.0、1.0 μg/mL)，于 -20 ℃遮光保存，备用。用甲醇稀释杀虫剂混标溶液，制得杀虫剂的混合标准中间液(10.0、1.0 μg/mL)，于 -20 ℃遮光保存，备用。以甲醇为溶剂，制得11 种农药的混合标准工作液(100.0、10.0 ng/mL)，现配现用。
本研究用于方法开发与验证的草鱼采购于北京市农贸市场，采集的样品冷藏运输回实验室；
经去皮、去骨，取可食用部位，用均质机研磨捣碎，于-20 ℃冷冻保存。
1.2 仪器与设备
QTRAP®5500 超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱仪 (美国SCIEX 公司)；
CAFS clean-up column 一步净化仪 (中国水产科学研究院)；
SB-5200 DTN 超声波清洗机 (宁波新芝生物科技股份有限公司)；
MVM-2500 多管涡流混合器(上海泰坦科技股份有限公司)；
MS 3 Basic 基本型旋涡混匀器 (德国IKA 公司)；
H-2050 R 台式高速离心机 (湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；
NEVAPTM112 氮吹仪 (美国Organomation Aossociates公司)；
AB265-S 双量程分析天平(0.01/0.1 mg)、PL 2002 电子天平(0.01 g)[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；
0.22 μm Nylon 针式过滤器 (浙江欧尔赛斯科技有限公司)。
1.3 检测条件
色谱条件：BEH C18色谱柱 (2.1 mm × 100 mm，1.7 μm，赛默飞世尔科技有限公司)；
流动相A 相为V(甲酸) :V(水) = 1 : 999，B 相为V(甲酸) :V(乙腈)=1 : 999；
柱温为40 ℃；
进样量为5 μL；
采用梯度洗脱程序 (表1)。
表1 梯度洗脱程序Table 1 The gradient elution program
质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式下采用多反应监测(MRM)模式采集数据。离子源参数：气帘气压力 (CUR) 0.24 MPa；
喷雾电压 (IS) 5 500.0 V；
离子源温度 (TEM) 500.0 ℃；
喷撞气 (CAD) Medium；
雾化气压力 (GS1) 0.38 MPa；
辅助气压力 (GS2) 0.38 MPa；
碰撞室射入电压(EP) 10.0 V；
碰撞室射出电压 (CXP) 13.0 V。其他质谱参数信息见表2。
表2 11 种农药的质谱参数Table 2 Mass spectrum parameters of 11 pesticides
1.4 样品前处理
提取：将冷冻草鱼鱼糜解冻至室温，称取5.0 g匀浆后的草鱼样品于50 mL 离心管中；
加入20 mL乙腈，于2 500 r/min 下涡旋振荡1 min；
加入1 g氯化钠，混匀，离心管依次在超声波水浴中浴浸提取20 min；
先于 -20 ℃下冷冻30 min 后，再于6 000 r/min 下离心10 min；
取上清液，用乙腈定容至20 mL，待净化。
净化：准确移取1 mL 上清液，采用CAFS clean-up 净化柱 (50 mg PSA) 净化。净化流程如图1 所示：CAFS clean-up 净化柱固定于本课题组自行研制的快速自动化净化仪上，向上拉动活塞至上样口上面，柱口上接0.22 μm 有机相滤膜，下接进样瓶，使用移液枪将1 mL 上清液通过CAFS clean-up 净化柱加样孔加入到柱管中；
净化仪自动推动活塞使上清液依次经过净化柱填料层和滤膜，直接转移到进样瓶；
待检测。
图1 CAFS clean-up column 净化流程[27]Fig. 1 The procedure of CAFS clean-up column[27]
1.5 数据处理
采用SCIEX 的Analyst®Software 软件对数据进行采集，MultiQuant 3.0.3 软件进行定量分析。所有数据均由Microsoft Excel 2016 计算，由OriginPro 2021 软件作图。
2.1 仪器条件的优化
在正离子扫描模式监测下，分别将不同种类的农药标准品溶液注入电喷雾离子源，进行离子扫描，得到定量离子和定性离子，进一步优化碰撞能量等参数，详见表2。在确定质谱参数的基础上，对流动相条件进行优化。首先比较了有机相为乙腈或甲醇时对目标化合物色谱峰的影响。结果表明，有机相为乙腈时各目标物的色谱峰良好；
这可能是因为进样液 (即净化处理后的流出液) 的溶剂为乙腈，溶剂效应相对较小。进一步分别在水相和乙腈相中加入体积分数为0.1% 的甲酸以提高目标化合物在ESI+模式下的电离效率，在定量限浓度下草鱼基质中11 种农药的色谱图见图2。
图2 草鱼样品中11 种农药的色谱图(1LOQ)Fig. 2 Chromatograms of 11 pesticides in grass carp sample spiked an LOQ level
2.2 提取条件优化
为了提高草鱼中11 种农药的提取效率，对比了纯乙腈和V(甲酸) :V(乙腈)=1 : 999 溶液对11 种农药的提取效果 (样品中各农药的添加水平均为4 μg/kg)。如图3 所示：经两种提取液提取后，11 种农药的平均回收率均在80%～120% 之间，除杀线威和扑草净外，其余9 种农药均经纯乙腈提取后回收率更高，并且采用纯乙腈提取后，11 种农药回收率之间的相对标准偏差更低，说明纯乙腈对11 种农药的整体提取效果更好、更稳定。这与Pang 等[29]的研究结论基本一致，同时考虑试验的简便性和经济性，最终选择纯乙腈作为提取溶剂。
图3 乙腈和V (甲酸) : V(乙腈) = 1 : 999 对草鱼样品中11 种农药的提取效果对比 (n = 3)Fig. 3 Comparison of extraction effects of 11 pesticides in grass carp using acetonitrile and acetonitrile containing 0.1% formic acid (n = 3)
2.3 滤过型净化柱参数的优化
2.3.1 净化填料种类优化 由于水产品基质中含大量的脂肪和蛋白质等干扰成分，而用乙腈进行提取时，油脂会伴随着目标物一起被提取出来，影响定性和定量分析结果。因此，需采用CAFS clean-up 净化柱对提取液进行净化处理。C18和PSA是常用的净化材料，C18可去除脂质，PSA 可去除脂肪酸和糖分[30]。本研究选择不净化以及分别以50 mg C18和50 mg PSA 作为CAFS clean-up 净化柱进行净化，对比研究了净化柱填料的种类对净化效果的影响。如图4 所示：草鱼样品经填料为50 mg C18的净化柱净化处理后，11 种农药的回收率普遍偏低，半数以上农药的回收率低于80%；
不净化处理的草鱼样品中11 中农药的整体回收率情况不佳，其中灭线磷和扑草净的回收率低于80%，其余9 种农药回收率虽在80%～120%内，但除甲萘威和乐果外，均低于经50 mg PSA 为填料的净化柱净化处理后的回收率；
而采用50 mg PSA 为填料的净化柱净化处理后，草鱼样品中11 种农药的回收率均在80%～120% 内。因此，最终选择PSA 作为净化填料。
图4 不同净化填料对草鱼样品中11 种农药回收率的影响 (n=3)Fig. 4 Effects of different types of purification sorbents on recoveries of 11 pesticides in grass carp (n=3)
2.3.2 净化填料用量优化 在确定净化填料的基础上，分别采用50、100、200 和300 mg 的PSA对CAFS clean-up 净化柱填料含量进一步优化。如图5 所示：采用300 mg PSA 为净化填料时11 种农药的回收率过低，除扑草净外，均低于80%；
采用200 mg PSA 为净化填料时11 种农药的回收率普遍偏低，多达7 种农药的回收率不足90%；
采用100 mg PSA 为净化填料时11 种农药的整体回收率情况不佳，其中异丙威、仲丁威、速灭威和灭线磷的回收率低于70%；
而采用50 mg PSA为净化填料时11 种农药的回收率均在80%～120%内。故CAFS clean-up 净化柱选择使用50 mg PSA 作为最终净化填料。
图5 不同质量净化填料对草鱼样品中11 种农药回收率的影响 (n=3)Fig. 5 Effect of different amount of purification sorbents on recoveries of 11 pesticides in grass carp (n=3)
2.3.3 净化次数优化 在确定净化填料种类和用量的基础上，分别对比了不净化和净化1 次以及同一待净化液反复通过同一净化柱2 次、3 次净化处理对净化效果的影响。如图6 所示：3 次净化后草鱼样品中11 种农药的整体回收率情况不佳，其中杀线威和扑草净的回收率接近120%，而仲丁威回收率仅70%左右；
2 次净化处理后11 种农药的整体回收率情况同样不佳，其中杀线威、灭线磷和扑草净的回收率接近甚至超过120%，而甲硫威和仲丁威回收率均不足80%；
不净化处理的农药整体回收率情况尚可，但灭线磷和扑草净的回收率同样不足70%；
而1 次净化处理后的农药回收率均在80%～120%内。综合考虑，对草鱼样品进行1 次净化处理，11 种农药即可获得较好的回收率并可保证快速检测。
图6 不同净化次数对草鱼样品中11 种农药回收率的影响 (n=3)Fig. 6 Effect of different cleanup times on recoveries of 11 pesticides in grass carp (n=3)
2.4 基质效应考察
采用电喷雾电离定量分析会受到样品中基质或其他干扰引起的离子抑制或增强的显著影响[31]；
这种现象通常称为基质效应 (Me)，基质效应的存在会影响定量结果。本研究通过(基质中标准曲线斜率/溶剂中标准曲线斜率-1) × 100%，对草鱼样品中11 种农药的基质效应进行考察评估，当0≤|Me|≤20%时为弱基质效应，当20%＜|Me|＜50%时为中等基质效应，当|Me|≥50% 时为强基质效应[32-34]。如图7 所示：11 种农药的|Me|均大于20%，部分农药的|Me|大于50%；
即11 种农药在草鱼样品中均表现为中等或强基质效应。故本研究选择基质标准曲线，以外标法定量分析。
图7 11 种农药的基质效应Fig. 7 Matrix effects of 11 pesticides
2.5 方法确证
2.5.1 线性方程和定量限 以空白草鱼样品为基质，采用空白基质加标方法配制标准曲线，得到1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 和50.0 μg/kg 不同浓度的混合基质标准工作液，按上述方法检测；
以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法制作标准曲线。以阴性草鱼样品为基质，以信噪比≥10 为依据，并根据GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检验》中关于被测组分含量低于0.1 mg/kg 时，回收率范围为60%～120%的要求，对11 种农药进行定量限 (LOQ) 的考察。各组分线性回归方程、相关系数和定量限见表3。11 种农药在1.0～50.0 μg/kg 内的线性关系良好，相关系数均大于0.99；
定量限为1.0～2.0 μg/kg，说明本方法具有较高的灵敏度。
表3 11 种农药的标准曲线和定量限Table 3 Standard curves and limit of quantifications of 11 pesticides
2.5.2 方法正确度和精密度 按照1.4 节中样品前处理方法，选取空白样品，添加并制备得到3 个不同水平的阳性样品 (1 × LOQ、2 ×LOQ 和10 ×LOQ)。重复性采用相对标准偏差 (RSD) 衡量。每个水平重复6 次，计算添加回收率及日内相对标准偏差；
按相同的样品处理方式，连续测定3 d，计算3 d 内每个水平测得值的相对标准偏差，作为方法的日间相对标准偏差。结果如表4 所示，11 种农药在3 个不同添加水平下的回收率为83%～119%，日内相对标准偏差为2.6%～20%，日间相对标准偏差为0.7%～15%。表明本研究建立的检测方法正确度高且重复性好，符合农药残留分析要求[35]。
表4 草鱼中11 种农药的回收率和相对标准偏差 (n=6)Table 4 Recoveries and RSD of 11 pesticides in grass carp (n=6)
2.6 方法应用
为了进一步验证方法的可行性，应用所建立的方法对从市场购买的草鱼、鲤鱼、石斑鱼、大菱鲆、南美白对虾以及鳗鱼共6 个不同种的水产品进行检测。结果发现，杀线威在草鱼、石斑鱼和大菱鲆中以及扑草净在大菱鲆中有微量残留，但均低于定量限，可视为未检出；
杀线威在鳗鱼中检出量高于定量限，为1.22 μg/kg。
本研究采用CAFS clean-up column 净化，结合UPLC-QTRAP-MS/MS 对草鱼中11 种农药残留量进行检测。结果显示，11 种农药的线性关系良好，相关系数均大于0.99；
定量限为1.0～2.0 μg/kg。11 种农药在3 个不同添加水平下的回收率为83%～119%，日内相对标准偏差为2.6%～20%，日间相对标准偏差为0.7%～15%。本研究所采用的CAFS clean-up column 可实现对提取液的自动化批量净化，并且无需氮吹浓缩，净化和过膜操作可同步进行 (约3 min)，大大提高了检测效率，并显著减少了有机溶剂和针式过滤器的用量。此方法灵敏度和正确度高，重复性好，方便快捷且经济高效。将本方法运用于实际样品的分析，在鳗鱼中检出杀线威残留。
谨以此文庆贺中国农业大学农药学学科成立70 周年。
Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.
作者简介：
封腾望, 男，硕士研究生。2020年6 月于河北农业大学水产养殖学专业获农学学士学位。2020 年9 月考入上海海洋大学水产与生命学院攻读水产养殖学学术硕士学位，主要研究方向为水产品中药物残留的快速检测技术。
李晋成，男，副研究员，硕士生导师。2012 年在中国科学院化学研究所获得分析化学博士学位。博士毕业后就职于中国水产科学研究院，主要从事水产品中药物残留检测、残留消除规律及标准化等方面研究工作。相关成果先后获2020 年中国水产学会范蠡科学技术奖(科技进步类)二等奖等多项。现任上海海洋大学硕士生导师、中国水产学会青年工作委员会委员。
猜你喜欢 草鱼乙腈填料 调节阀阀杆密封泄漏分析及处理产业与科技论坛(2022年18期)2022-10-19污水处理中新型无机除磷填料的研究进展中国资源综合利用(2022年9期)2022-10-13见证！草鱼再次崛起当代水产(2022年7期)2022-09-20高纯乙腈提纯精制工艺节能优化方案煤化工(2022年3期)2022-07-08拼品质！拼服务！150万吨草鱼料的湖北，谁能笑到最后？当代水产(2022年5期)2022-06-05草鱼出血病的研究进展及免疫防治当代水产(2022年3期)2022-04-26SBR处理生活污水工艺中填料性能研究绿色科技(2021年4期)2021-04-06四种市售色谱级乙腈的质量比较首都食品与医药(2020年1期)2020-10-21离心泵软填料密封问题的分析与对策中小企业管理与科技·中旬刊(2018年8期)2018-11-12屋檐下的小草鱼广东第二课堂·小学(2018年9期)2018-10-24