河北中医学院附属沧州中西医结合医院内分泌糖尿病科
陈晓婷 潘保朝△ 张 辉△ 苏秀海 孙文娟 吕树泉(沧州 061001)
提要 目的：研究健脾固肾化瘀汤对糖尿病肾脏病(DKD)大鼠肾脏病理变化的改善及肾病蛋白(Nephrin)、单核细胞趋化因子1(MCp-1)和类胰岛素1号生长因子(IGF-1)的影响。方法：采用雄性Sprague-Dawley大鼠腹腔注射链脲霉素(STZ)来复制糖尿病肾病大鼠模型。根据随机数表随机选择6组，即正常组、模型组、雷米普利组、健脾固肾化瘀汤低、中、高剂量组(1.9、3.8、7.6 g/kg)，各10只。用药8周后，测定各组血清肌酐、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇和24 h尿白蛋白的指标。在光学显微镜下观察肾脏的形态学变化。用免疫组化法观察Nephrin、MCp-1和IGF-1的表达，用RT-PCR方法观察Nephrin、MCp-1、IGF-1 mRNA的表达。结果：与正常组相比，模型组的甘油三酯、总胆固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白、MCp-1和IGF-1 mRNA的水平明显升高(P<0.05)，Nephrin mRNA的表达明显降低(P<0.05)；
与模型组相比，健脾固肾化瘀汤各组的甘油三酯、总胆固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白、MCp-1、IGF-1 mRNA水平下降(P<0.05)，Nephrin mRNA水平明显提高(P<0.05)，且大鼠肾脏组织细胞排列整齐。结论：健脾固肾化瘀汤可下调IGF-1和MCp-1 mRNA的表达，上调Nephrin mRNA的表达，改善肾组织的病理变化，起到保护作用。
由于人口的老龄化程度逐渐加深，全球2型糖尿病的患病率在过去30年中迅速增加，这表明其微血管并发症糖尿病肾脏病(DKD)的发病率也在迅速提高[1]。DKD为终末期肾病的主要病因，但DKD的发病机制尚不明确，目前尚无特异性治疗方法。西医治疗DKD的主要手段是通过药物控制血压、血脂和葡萄糖水平[2]，一些新的药物如胰高糖素样肽-1受体激动剂、钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂等能在一定程度上减少蛋白尿、改善肾功能进而延缓DKD的进展，但是也会产生胃肠道不适、低血糖、胰腺炎等副作用[3-4]。中医药因其多靶点、多组分、多环节、低毒副作用的优势，已经成为改善DKD患者肾功能，阻止疾病进展的重要治疗手段。
健脾固肾化瘀汤是河北省沧州中西医结合医院依据中医经典理论结合多年临床经验同时吸收名家经典方剂形成，前期研究表明对DKD患者有良好的临床效果[5]，但具体作用机制有待考证。本研究首先通过高脂饲料联合链脲霉素(STZ)注射，建立DKD大鼠模型，明确健脾固肾化瘀汤对DKD大鼠的治疗作用，其次通过RT-PCR、免疫组化等方法检测健脾固肾化瘀汤干预后DKD大鼠肾脏组织中肾病蛋白(Nephrin)、单核细胞趋化因子1(MCp-1)、类胰岛素1号生长因子(IGF-1)的表达情况，探究健脾固肾化瘀汤治疗DKD的内在机制。
1.1 动物 60只雄性SPF级SD大鼠，体质量210～230 g，由中国医学科学院放射医学研究所提供[动物证书编号：11401300065459，单位许可证编号：SYXK(津)2014-0002]。标准正常饮食。所有动物都被安置在一个温度和湿度可控的环境中[12 h光/暗循环，(21±2)℃，相对湿度(45±10)%]，并允许自由采食和饮水。
1.2 主要试剂 Trizol试剂盒(Cat # 15596-026)；
TIANScript RT KIT(Cat # KR104-02)；
SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(Cat # FP205)。
1.3 仪器 QL-902涡旋摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；
5415D离心机(Eppendorf)；
生物光度计(Eppendorf)；
ABI7500荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)。
1.4 药品 健脾固肾化瘀汤由黄芪60 g，党参10 g，黄精15 g，白术12 g，茯苓、山药、芡实、金樱子各15 g，山茱萸12 g，熟地黄15 g，当归12 g，川芎30 g，僵蚕、蝉蜕各10 g，水蛭6 g，酒大黄、淫羊藿各10 g组成。中药是由北京康仁堂药业有限公司生产的中药颗粒，按比例加入纯净水制成悬浮液备用。雷米普利片(H200030724)，研末按比例加入纯净水制成悬浮液备用。
2.1 分组与建模 大鼠适应性喂养1周，根据随机数表随机分为6组，即正常组、模型组、雷米普利组、健脾固肾化瘀汤低、中、高剂量组(简称低、中、高剂量组)，每组10只。正常组予常规饲料，其余50只给予高糖高脂饲料(10%猪油、20% 蔗糖、2.5% 胆固醇、67.5% 常规饲料)。特殊饲料喂养7周后于第7周末进行腹腔注射STZ 30 mg/kg[以0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=4.4)配制成1%的STZ溶液]，注射前12 h禁食不禁水。72 h后尾静脉采血检测随机血糖≥16.7 mmol/L，即可认为糖尿病大鼠造模成功。糖尿病大鼠继续喂养1周，1周后开始用代谢笼收集大鼠24 h尿，检测24 h尿蛋白定量。以血糖水平≥16.7 mmol/L、尿白蛋白≥30 mg/24 h，作为DKD动物模型建立标准[6]。
2.2 药物干预 在造模成功后12 h开始服药。健脾固肾化瘀汤组用健脾固肾化瘀汤煎剂给药，1次/d，2 mL/次，剂量按等效人体剂量计算。此外，雷米普利组作为阳性对照[7]。健脾固肾化瘀汤分低、中、高剂量组使用，分别为1.9、3.8、7.6 g/kg, 健脾固肾化瘀汤中剂量组3.8 g/kg相当于健脾固肾化瘀汤在人类成人中的日用量，其计算公式如下：等效剂量(g/kg)=人类粗制药材的临床用量(g/kg)×6.25。雷米普利组灌胃2 mL/次，1次/d(雷米普利粉末在正常生理盐水中稀释至0.001 g/kg[8])。正常组和模型组分别用相同剂量的正常生理盐水胃内注射，每天1次。各组干预持续8周。在此期间，大鼠自由饮水，标准饮食，环境温度为(20±2)℃。没有使用胰岛素和其他降糖药物。
2.3 样本采集 治疗8周后，所有大鼠存活，各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，用毛细玻璃管从内眦处采血。将采集的血液置于离心机中，以3 000 r/min的速度高速离心15 min，取上清液储存于-80 ℃以备后用。在麻醉状态下，通过颈椎脱位将大鼠处死，并立即从腹部取出双侧肾脏。部分肾脏组织被置于4%多聚甲醛溶液中进行固定。其余的肾脏组织在-80 ℃下保存，以备将来使用。
2.4 苏木精-伊红(HE)染色 取肾脏组织进行常规石蜡包埋和切片。石蜡切片厚度为4 μm，然后进行HE染色，显色后在显微镜下观察组织的病理变化。
2.5 生物化学检测 使用全自动生化分析仪对血清尿素氮、肌酐、甘油三脂、总胆固醇和24 h尿白蛋白定量水平进行检测。
2.6 RT-PCR法检测肾皮质Nephrin、MCp-1和IGF-1mRNA的表达 RT-PCR对IGF-1 mRNA、Nephrin mRNA和MCp-1 mRNA表达进行检测，严格按照定量PCR仪的操作说明书进行。每组10只大鼠进行基因表达分析。肾脏中RNA的分离方法如下。(1)将组织样本用研钵磨碎，放入离心管中，加入1 mL Trizol 5～10 min；
(2)加入0.2 mL氯仿，上下剧烈搅拌15～30 s，然后静置3 min(冰浴或室温)；
(3)4 ℃，12 000 r/min离心15 min；
(4)取水相放入新的EP管，加入0.5 mL异丙醇，混匀，冰浴10 min；
(5)4 ℃下12 000 r/min离心10 min；
(6)倒出上层液体，沉淀物(1 mL)用75%冰乙醇，混匀；
(7)4 ℃，12 000 r/min离心5 min；
(8)干燥。加入DEPC处理水以溶解RNA，测量浓度，并在-80 ℃下保存。然后取5 μL RNA，在1%琼脂糖凝胶上电泳，检查RNA的完整性。
依次加入2.5 μL稀释10倍的PCR缓冲液，1.5 μL MgCl2 溶液，0.5 μL上游引物和下游引物，最后加水配成总体积25 μL的反应体系。反应体系用DPEC水稀释至50 μL，并保存在-20 ℃。最后，用荧光定量PCR仪进行2-△△Ct法进行数据的相对定量分析，计算各样品靶基因的相对定量结果，即其他样品靶基因mRNA转录水平相对于对照样品的差异。
2.7 通过免疫组化染色检测肾脏中Nephrin、MCp-1和IGF-1的蛋白质表达情况 通过免疫组化染色评估肾脏中Nephrin、MCp-1和IGF-1的表达[9]。石蜡常规切片2～3 μm,脱蜡至水；
PBS冲洗5 min×3次;柠檬酸盐缓冲液中行抗原热修复1 min 30 s,冷却至常温；
PBS冲洗5 min×3次；
分别滴加50～100 μL一抗兔抗大鼠Nephrin、MCp-1、IGF-1多抗,4 ℃过夜,同时用PBS代替一抗作阴性对照；
次日用PBS洗3次,每次5～10 min;滴加50～100 μL山羊抗兔IgG-FITC,37 ℃,孵育40 min,避光；
PBS(振摇)洗涤3次,每次10 min,避光；
擦干,封片,4 ℃避光保存待测;全自动多功能荧光显微镜观察,光学显微镜下观察到肾组织棕黄色颗粒沉积为阳性，用Image pro plus对数据进行分析。Nephrin、MCp-1和IGF-1在肾小球中表达。对Nephrin、MCp-1和IGF-1的蛋白质相对水平进行量化并与对照组进行比较。记录了20个随机选择的512×512像素、分辨率为0.4348 μm的彩色视频图像。根据RGB颜色参数观察综合光密度。
3.1 各组大鼠干预后的肌酐、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇和24 h尿白蛋白定量水平 干预8周后，与正常组相比，模型组大鼠的肌酐、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇、24 h尿白蛋白水平明显升高，差异有显著性(P<0.05)。与模型组相比，雷米普利组、健脾固肾化瘀煎剂低、中、高剂量组的甘油三酯、总胆固醇、肌酐、尿素氮和24 h尿白蛋白均明显降低(P<0.05)；
与雷米普利组相比，健脾固肾化瘀各组的肌酐、尿素氮、24 h尿白蛋白均明显降低(P<0.05)，其中以中、高剂量组更为明显，甘油三酯、总胆固醇降低但差异无显著性(P>0.05)。详见表1。
表1 各组大鼠干预8周后的尿素氮、肌酐、甘油三酯、总胆固醇和24 h尿白蛋白定量水平的变化
3.2 Nephrin、MCp-1、IGF-1 mRNA在各组大鼠干预后的表达效果 干预8周后，与正常组相比，模型组IGF-1 mRNA和MCp-1 mRNA的表达明显升高(P<0.05)，而Nephrin mRNA的表达明显降低(P<0.05)。与模型组相比，雷米普利组、健脾固肾化瘀汤低、中、高剂量组IGF-1 mRNA和MCp-1 mRNA的表达明显降低(P<0.05)，其中IGF-1 mRNA的表达以雷米普利组最为明显，MCp-1 mRNA的表达以健脾固肾化瘀汤高剂量组最为明显；
雷米普利组、健脾固肾化瘀汤低、中、高剂量组Nephrin mRNA的表达升高(P<0.05)，且以健脾固肾化瘀汤高剂量组更为明显。详见表2。
表2 各组大鼠干预8周后的Nephrin、MCp-1、IGF-1 mRNA表达水平
3.3 健脾固肾化瘀汤对大鼠Nephrin、MCp-1、IGF-1蛋白表达水平的影响 从图1和表3可以看出，干预8周后模型组IGF-1和MCp-1蛋白的表达明显高于正常组(P<0.05)，而Nephrin蛋白的表达则明显低于正常组(P<0.05)。与模型组相比，雷米普利组、健脾固肾化瘀汤低、中、高剂量组IGF-1和MCp-1蛋白的表达明显降低(P<0.05)，其中IGF-1蛋白的表达以雷米普利组最为明显，MCp-1蛋白的表达以健脾固肾化瘀汤高剂量组最为明显；
雷米普利组、健脾固肾化瘀汤低、中、高剂量组Nephrin 蛋白的表达显著升高(P<0.05)，且以健脾固肾化瘀汤中、高剂量组更为明显。
注：A.正常组；
B.模型组；
C.雷米普利组；
D.低剂量组；
E.中剂量组；
F.高剂量组
表3 各组大鼠肾脏中Nephrin、MCp-1、IGF-1阳性区域的综合光密度(×103)
3.4 健脾固肾化瘀汤对大鼠肾脏组织病理变化的影响 从图2可以看出，正常组的肾脏组织表现正常；
模型组的肾脏组织细胞增生，细胞排列紊乱，肾小球内的细胞减少；
雷米普利组，健脾固肾化瘀煎剂低、中、高剂量组干预后，细胞排列整齐。
DKD作为最令人担忧的糖尿病慢性微血管并发症之一，是指由糖尿病所致的慢性肾脏结构和功能障碍的疾病，其病变可累及全肾(包括肾小球、肾小管、肾间质等)。早期通常表现为微量白蛋白尿，随后逐步进展出现大量白蛋白尿、肾小球滤过率进行性下降、血肌酐进行性上升。如果不及时进行治疗，将会导致严重后果，最终发展为终末期肾衰竭[10]。现代医学在治疗上往往从降糖、降压、肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)阻断、抗氧化、抗炎和改善微循环等方面多因素干预疾病[11]，虽有一定的效果，但大多只是对症治疗，延缓病情，并且在应用如血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类药物时易引起干咳、升高血钾等诸多不良反应，不利于稳定病情，所以说现代医学仍缺乏有效药物阻止病情发生发展。
中医学在治疗DKD上历史悠久，应用广泛，通过辨证论治和整体治疗等方法，在治疗DKD上有多靶点、多通路的优势。其中健脾固肾化瘀汤全方共奏健脾固肾、化瘀通络之功。其中重用黄芪，以健脾益气、消肿利尿，补诸虚不足；
党参健脾补气；
熟地黄、山茱萸、山药、黄精均有补虚益肾之功；
芡实、金樱子固精益肾；
白术益气健脾，茯苓利水淡渗，两者合用，能够利水湿从小便去；
当归养血活血；
僵蚕、蝉蜕、水蛭用以化瘀通络[12]。临床研究中已经证实健脾固肾化瘀汤可显著改善DKD患者的空腹血糖、餐后2 h血糖、胆固醇、甘油三酯、血压、24 h尿微量白蛋白水平等[13]，但其作用机制尚不明确，探讨其治疗机制有利于进一步应用于临床DKD患者，并为其提供实验与理论依据。
本项研究中，笔者利用高脂饲料联合STZ注射制备大鼠的DKD模型，结果显示，模型组大鼠血清中的尿素氮、甘油三酯和胆固醇以及尿液中的蛋白质水平都有所上升。肾脏的HE染色显示DKD模型大鼠的肾组织细胞过度增殖和排列紊乱，肾小球细胞减少，这与其他关于DKD的动物研究一致[14]，表明造模成功。本研究结果显示健脾固肾化瘀汤能够改善模型大鼠的肾组织细胞，降低IGF-1蛋白和MCp-1蛋白的表达量，提高Nephrin蛋白的表达量，且呈现出剂量依赖的特征。
在糖尿病发病机制的研究中，DKD发生发展与足细胞关系密切[15]。裂孔隔膜作为特有的足细胞间的细胞链接，是一种特殊的蛋白质复合物，连接着相邻的荚膜细胞足突，与DKD蛋白尿的产生密切相关。Nephrin作为裂孔隔膜上的特异性膜蛋白的一种，可通过正式或反式链接嗜异性结合，形成顺势异聚体，它的存在能够使得裂孔隔膜的结构完整，功能正常[16]。众多实验[17-18]已经证实Nephrin对裂孔隔膜十分关键，同时Nephrin蛋白的减少也会对肾小球的硬化造成一定的影响[19]。在本研究中，模型组大鼠Nephrin蛋白表达减少，健脾固肾化瘀汤组大鼠在低、中、高剂量健脾固肾化瘀汤干预后，Nephrin蛋白的表达量的增加，能够在一定程度上减轻DKD大鼠的肾脏损伤，延缓疾病的进程。
炎症反应作为DKD的发病机制之一[20]，近年来受到广泛关注。MCp-1作为一种C-C型趋化因子，MCp-1对单核细胞有特异的趋化激活作用，能促进炎症反应的发生[21]。MCp-1是由肾小球系膜细胞和血管内皮细胞等多种细胞进行分泌，从而增加巨噬细胞黏附性，进一步分泌致纤维化细胞因子并加重肾组织的损伤[22]。已有研究证实[23-25]，MCp-1的大量出现会使得肾脏功能受损，同时由于MCp-1在单核巨噬细胞的浸润和激活中起着重要作用，会进一步加重肾脏损伤。在本研究中，模型大鼠在服用健脾固肾化瘀汤后，MCp-1水平下降，抑制了肾脏中致纤维化细胞因子的表达，降低了血管的通透性，改善了蛋白尿的情况。
IGF-1作为一种多肽神经营养因子，具有与胰岛素相似的结构和功能[26]。有研究已经证实IGF-1水平升高与2型糖尿病患者肾脏病变损伤程度保持一致[27-28]，同时IGF-1作为一种新的血浆标志物对于DKD早期诊断及疾病预后发展判定具有一定的临床意义[29-30]。已有实验证实IGF-1可促进肾脏系膜细胞产生层黏蛋白、纤维连接蛋白、胶原蛋白，使得肾小球硬化，加剧DKD的进程[31]。本研究表明健脾固肾化瘀汤通过降血糖、改善肾小球微循环降低IGF-1含量，以改善肾小球的硬化，保护肾脏。
综上所述，健脾固肾化瘀汤对DKD的肾脏有很好的改善和保护作用，其作用机制可能与调控Nephrin mRNA、MCp-1、IGF-1的表达有关，为其临床应用提供了理论基础。然而仍有不足，本研究只是在一定程度上揭示了健脾固肾化瘀汤治疗DKD的作用机制，其具体的通路、靶点的研究仍是研究的重点方向。
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