田 家 英， 张 江 华， 崔 励， 王 大 鸷
( 大连工业大学 轻工与化学工程学院, 辽宁 大连 116034 )
脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一类能够催化水解、酯化等多种反应的高效生物催化剂，被广泛应用于食品加工[1]、乳制品[2]、饲料工业[3]、生物能源[4]、生物医药[5]、洗涤[6]、纺织[7]等领域。脂肪酶在催化反应的过程中，具有较高的立体特异性和区域特异性及催化条件温和、环境友好、能耗低、副产物少等优点。然而，游离脂肪酶在催化过程中普遍存在稳定性、分离性、重复利用性差等缺点[8]，阻碍对其进一步的开发和应用。固定化脂肪酶被认为是克服游离脂肪酶上述缺点的有效方法之一。目前，常用的固定化酶技术主要有吸附法、共价结合法、交联法和包埋法，其中交联法得到广泛应用，主要因为其操作简便，同时又能使酶与载体结合牢固，进而提高固定化酶的重复利用性[9]。固定化酶的另一个技术要点为对固定化载体的选择，而高分子聚合物因其优异的稳定性和可控制的孔结构在固定化酶领域的应用受到广泛关注。近年来，聚芳醚砜(PAES)因其良好的耐高温、耐水解和尺寸稳定性而被广泛用作工程塑料[10-12]。PAES的刚性结构，使其热变形温度相对较高，因而可在高温下长期使用[13]；
此外，PAES表面形态和结构的特殊性，使其具有较大的比表面积、更快的吸附速度和良好的生物相容性[13]；
再者，PAES具有对强酸和强碱的耐受性高、可回收性好等优点，进一步表明其具有作为固定化酶优良载体的应用潜力[14-15]。本文以实验室自制含羧基侧链的PAES多孔聚合物为载体，采用交联法进行固定化脂肪酶的制备，通过单因素及响应面试验探究固定化脂肪酶的最佳制备条件，并对该固定化脂肪酶进行催化酯化反应的应用了初探。
1.1 材料与仪器
PAES-C，实验室制备；
米曲霉脂肪酶，阿拉丁化学试剂公司；
FA25高剪切均质乳化机，THZ-82A恒温水浴摇床。
1.2 方 法
1.2.1 固定化脂肪酶的制备
将戊二醛溶解在0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0)中，得到1.0%的戊二醛溶液。用戊二醛溶液活化PAES-C，同时在体系中加入等质量的脂肪酶。将混合物置于恒温水浴摇床(200 r/min)中，并在30 ℃下孵育5 h。孵育结束后用磷酸盐缓冲液洗涤2～3次，去除载体表面的戊二醛及未固定的游离酶，室温干燥后即得到固定化脂肪酶。
1.2.2 单因素优化试验
固定摇床转速为200 r/min，依次改变戊二醛质量分数、戊二醛添加量、pH、固定化时间、固定化温度等因素，研究不同变量对固定化脂肪酶酶活的影响规律。各因素水平梯度：戊二醛质量分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，戊二醛添加量为1、2、3、4、5 mL，pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，固定化时间为3、4、5、6、7 h，固定化温度为20、30、40、50、60 ℃。
1.2.3 响应面优化试验
根据单因素对固定化脂肪酶的影响实验结果，选取戊二醛质量分数(A)、pH(B)、固定化温度(C)3个影响较为显著的单因素，并以酶活力为响应面值，根据Box-Behnken设计原理设计响应面试验，从而得到固定化酶的最佳制备条件。试验因素水平如表1所示。
表1 Box-Behnken试验因素水平
1.2.4 脂肪酶酶活力的测定方法
参照GB/T 23535—2009的标准方法测定脂肪酶的水解活力。
底物溶液的制备：将橄榄油和4%聚乙烯醇溶液以体积比1∶3的比例混合，分两次使用高剪切均质乳化机进行乳化处理，每次持续3 min，且中间间隔5 min。将所得底物溶液置于冰箱中4 ℃ 储存，每次使用前需进行乳化处理。
脂肪酶水解活力的测定：向锥形瓶中加4 mL底物溶液和5 mL磷酸钠缓冲液(50 mmol/L，pH=7.5)。将该混合液置于37 ℃水浴中保温5 min，向其中加入固定化酶或一定量游离酶，并在37 ℃、100 r/min反应15 min，加入15 mL的95%乙醇终止反应。向混合液中滴入3～4滴酚酞指示剂，采用氢氧化钠溶液(0.05 mol/L)进行脂肪酸释放量的滴定。同时进行空白对照实验。所有反应均采取三平行操作，并取其平均值。酶活力单位(U)是指在37 ℃、pH=7.5、100 r/min条件下每分钟产生1 μmol游离脂肪酸(μmol/min)的游离酶量或固定化酶量[16]。
酶活计算公式[17]：
X=(V-V0)×c×10/tm
式中：V为滴定样品所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；
V0为滴定空白所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；
c为氢氧化钠溶液的浓度，mol/L；
t为酶反应的时间，15 min；
m为加入酶(固定化酶或游离酶)的质量，g。
1.2.5 固定化脂肪酶的催化应用
所制备固定化脂肪酶具备低耗能、环保等优势，进一步对其进行生物基衍生物2，5-四氢呋喃二甲醇(THFDM)与脂肪酸间催化酯化反应研究具有重要意义。THFDM由5-羟甲基糠醛加氢还原产生，属于绿色持续可再生资源，由于该固定化脂肪酶具有低温下高活性的应用特点，选用壬酸与THFDM在35 ℃低温下、摇床(200 r/min)中反应48 h。反应结束后，首先将固定化脂肪酶进行抽滤分离，并先后用去离子水和碳酸钠溶液洗涤滤液以除去未反应的反应物；
随后采用乙酸乙酯萃取该滤液，分离有机相、旋蒸去除溶剂，所得样品即为羧酸酯粗产物。对该粗产物进一步进行红外、核磁表征，分析其化学结构。
2.1 戊二醛质量分数对固定化脂肪酶酶活的影响
如图1所示，随着戊二醛质量分数的增加，固定化脂肪酶酶活有先增加后减小的趋势，且以1.5%戊二醛为交联剂时相对活性最高。戊二醛质量分数小于1.5%时，聚合物载体表面活化不足而易导致酶活低；
戊二醛质量分数高于1.5%时，戊二醛的过度自交联可能对脂肪酶的固定化产生空间位阻效应，最终导致固定化效率下降。因此，戊二醛对PAES-C表面活化的最佳质量分数为1.5%。
图1 戊二醛质量分数对固定化脂肪酶酶活的影响
2.2 戊二醛添加量对固定化脂肪酶酶活的影响
从图2可知，当戊二醛添加量为1～3 mL时，固定化脂肪酶的酶活呈现逐步上升趋势，且当添加量增至3 mL时，酶活达到峰值；
当戊二醛添加量大于3 mL时，酶活持续下降。这可能由于在酶的添加量一定的情况下，当戊二醛增加到一定量时，脂肪酶刚好与戊二醛完全发生交联反应；
戊二醛添加量继续增加时，交联反应过剩的戊二醛则容易发生自交联进而产生空间位阻效应，最终导致酶活出现下降趋势。因此，戊二醛添加量为3 mL时，脂肪酶的固定化效果最好。
图2 戊二醛添加量对固定化脂肪酶酶活的影响
2.3 pH对固定化脂肪酶酶活的影响
如图3所示，在pH 5.0～9.0，随着pH的升高，脂肪酶活性先呈现升高趋势，且当pH升高到8.0时酶活达到峰值；
当pH大于8.0时，脂肪酶活性呈下降趋势。这可能是因为戊二醛在强碱性环境中更容易与蛋白质分子结合形成环状吡啶的刚性结构，从而抑制酶与底物的结合，最终导致脂肪酶的活性降低。因此，固定化脂肪酶的最佳pH环境为8.0。
图3 pH对固定化脂肪酶酶活的影响
2.4 固定化时间对固定化脂肪酶酶活的影响
如图4所示，固定化3～6 h固定化脂肪酶的活性呈现先稳步上升后下降的趋势，当固定化时间增加到6 h时，酶活性达到峰值。这可能由于随着固定化时间的不断增加，脂肪酶分子持续进入PAES-C孔洞结构而被负载，当时间增加到一定程度，PAES-C与酶之间的负载位点达到饱和，过量的脂肪酶则会发生聚集，最终导致脂肪酶暴露在表面的活性位点数量下降[18]。因此，当固定化时间为6 h时，脂肪酶的固定化效果最佳。
图4 固定化时间对固定化脂肪酶酶活的影响
2.5 固定化温度对固定化脂肪酶酶活的影响
如图5所示，在20 ℃时脂肪酶活性较低，这可能因为低温条件下，席夫碱反应的反应速率较低，而载体表面的固定化脂肪酶尚未达到饱和；
随着温度的升高，反应速率提高，游离脂肪酶与载体结合更好。不断升高的温度会使脂肪酶失活，导致50 ℃以后脂肪酶活性急剧下降。因此，固定化脂肪酶的最佳制备温度为40 ℃。
图5 固定化温度对固定化脂肪酶酶活的影响
2.6 响应面法优化固定化脂肪酶的制备条件
2.6.1 二次回归模型拟合及方差分析
响应面试验结果采用Design Expert 8.0.6进行回归拟合。由表2可知，回归模型具有高度的显著性，P<0.000 1表明该模型极度显著，预测值与实际值比较相符，可以用来预测响应值。失拟项为0.301 3(大于0.05)不显著，说明回归方程拟合程度良好。离散系数(CV)为7.35%，说明模型方程可以较好地反映真实值。
表2 回归方程系数显著性检验表
由方差分析结果可知，固定化温度对酶活的影响最大(小于0.000 1)，其次是pH(0.002 0<0.01)，二者都达到了极度显著水平。戊二醛质量分数对酶活的影响较小，表现为差异显著(0.039 0<0.05)。交互项中AC、BC差异显著，表明戊二醛质量分数与固定化温度、pH与固定化温度的交互作用对酶活影响较大，在图6响应面图中也可明显看出。
(a) pH与戊二醛质量分数
2.6.2 最佳反应条件的预测及验证
通过回归模型的预测得到PAES-C固定化脂肪酶的最佳制备条件：戊二醛质量分数为1.5%，pH为7.46，固定化温度为40.89 ℃。此条件下，所制备固定化脂肪酶酶活的理论值最大，为1 267.22 U/g。结合生产实际，各因素水平调整为戊二醛质量分数为1.5%，pH为7.5，固定化温度为40 ℃，在此条件下通过3次平行实验进行验证，测得固定化脂肪酶酶活为1 424.73 U/g。结果与模型预测的理论值相近，说明该模型具有有效性。
2.7 固定化脂肪酶的催化应用初探
图7 酯化反应粗产物的红外表征
图8 酯化反应粗产物的碳核磁表征
以实验室自制带羧基侧链的PAES-C为载体进行固定化脂肪酶的制备，在单因素试验的基础上选取戊二醛质量分数、pH、固定化温度为独立自变量，固定化脂肪酶酶活为响应值，通过响应面法得到固定化脂肪酶的最佳制备条件：戊二醛质量分数为1.5%，pH为7.46，固定化温度为40.89 ℃。验证实验所得固定化脂肪酶酶活对应为1 424.73 U/g，表明该模型可以较好地预测固定化脂肪酶酶活。该固定化脂肪酶可在低温35 ℃ 下催化四氢呋喃二甲醇与壬酸反应获得具有双酯结构的酯化反应产物。本研究为聚合物载体固定化酶的研究提供了一定理论基础，并拓宽了聚合物在生物领域的应用范围。
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