谭章斌，徐由财，刘祺
肝癌是全球第六常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因[1-2]。尽管近年随着诊疗技术的不断提高，肝癌的发病率和死亡率都呈下降趋势，但是由于其起病隐匿，大多数患者在首次确诊时已处于中晚期，失去了最佳手术时机，即使接受根治性手术，仍有70%的患者在术后5年内出现复发或转移，远期疗效并不理想[3-4]。因此，寻找安全有效的药物用于肝癌治疗仍是研究重点。中药一直是药物开发的主要来源之一，紫杉醇等抗肿瘤药物来自于中药并广泛应用于临床。大黄是临床常用中药，大黄及其有效活性成分已显示出对多个肿瘤细胞系的抗肿瘤潜力[5]，但大黄抑制肝癌生长的作用机制仍有待进一步阐明。本研究目的是探索大黄提取物对HepG2人肝癌细胞的抑制作用和分子机制。
1.1 材料
大黄提取物购买自西安开来有限公司，我们已对该大黄提取物进行高效液相检测其质量[6]，大黄提取物使用DMSO进行溶解，本研究使用DMSO作为溶剂对照。p-p38MAPK(#4511)、p38MAPK(#8690)、Bax(#2774)、Bcl-2(#3498)以及GAPDH(#5174)等一抗购买自美国CST有限公司。MTS购买自美国Promega有限公司。钙黄绿素/PI染色试剂盒购买自日本东仁有限公司。Hochest33342试剂购买自碧云天有限公司。p38MAPK抑制剂SB203580购买自MCE有限公司。细胞培养基以及培养耗材购买自美国Gibco有限公司和美国Corning有限公司。
1.2 细胞培养
人肝癌细胞系HepG2从中国医学科学院细胞库(中国上海)购买。肝癌细胞采用含有10%FBS、100 U/mL青/链霉素的DMEM培养，并置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中常规培养。
1.3 细胞活性
肝癌细胞活性使用MTS试剂盒进行测量。肝癌细胞密度调整至1×104每孔，接种于96孔板中。细胞贴壁生长至70%～80%时，全培养基更换为不含血清的DMEM培养基并加入不同浓度(10～60 μg/mL)的大黄提取物。继续培养24 h后，弃培养基，每孔加入100 μL MTS培养液(DMEM：MTS=5 ∶1)。在细胞培养箱继续培养1 h后使用酶标仪于490 nm波长测量各孔吸光度，计算细胞活性。
1.4 平板克隆形成
消化收集肝癌细胞，并在60 mm培养皿中重新接种，初始密度调整为每皿200个细胞。细胞每3天用10、20、40 μg/mL大黄提取物干预一次，在37 ℃细胞培养箱培养14 d。在形成肉眼可见的细胞集落后使用4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫染色10 min。PBS 洗涤后晾干拍照。
1.5 钙黄绿素/PI染色
肝癌细胞存活/死亡程度使用钙黄绿素/PI染色试剂盒进行测量。肝癌细胞用10、20、40 μg/mL大黄提取物处理24 h，然后根据试剂盒说明书进行操作，弃培养基，加入钙黄绿素/PI混合液置于细胞培养箱培养30 min。通过荧光显微镜观察拍照。分别对存活和死亡的肝癌细胞计数，计算活/死细胞比例。
1.6 Hoechst33342/PI染色
将HepG2细胞接种到96孔板中，10、20、40 μg/mL大黄提取物处理24 h。随后去培养基，PBS洗涤细胞，加入终浓度为10 μg/mL Hoechst 33342 和5 μg/mL PI在室温下孵育30 min。最后通过荧光显微镜观察拍照。
1.7 蛋白印迹分析(Western Blot)
收集处理后的肝癌细胞，在冰上使用裂解缓冲液裂解30 min，然后离心收集上清液。将收集的蛋白样品加至10%的SDS-PAGE中，开始进行电泳分离。电泳完成后，将蛋白从SDS-PAGE转移到聚乙烯二氟化物膜。随后膜被转移到封闭液(含5%脱脂牛奶和0.05%Tween 20的TBST)中，室温摇床封闭1 h。然后一抗孵育过夜。TBST洗涤三次后，二抗孵育2 h，随后采用ECL发光法进行观察，条带采用Image J软件进行定量分析。
1.8 统计分析
2.1 大黄提取物抑制肝癌细胞活性
如图1A所示，经过24 h的药物处理后，大黄提取物呈浓度依赖性地降低了肝癌细胞的活性(P< 0.05)，大黄提取物对HepG2肝癌细胞的24 h IC50为40.46μg/mL。结合我们的既往研究[6]，我们采用10、20、40 μg/mL梯度浓度大黄提取物进行后续实验。与MTS结果相一致，平板克隆形成实验结果提示大黄提取物以浓度依赖的方式抑制肝癌细胞增殖能力(图1B)。钙黄绿素/PI染色结果如图1C所示，大黄提取物以浓度依赖的方式降低肝癌细胞存活，促进细胞死亡。10、20、40 μg/mL浓度大黄提取物组的肝癌细胞存活率分为83.65%、77.23%和63.88%，明显低于对照组的97.02%(P<0.05)。
2.2 大黄提取物激活肝癌细胞内p38MAPK诱导细胞凋亡
我们采用Hoechst33342 /PI染色评估大黄提取物对 HepG2细胞凋亡的影响。如图2A所示、对照组细胞核呈圆形，呈均匀蓝色；
而大黄提取物处理组(10～40 μM)出现了明显的核皱缩，核皱缩率显示出明显的浓度依赖性增加。我们接着通过Western blot检测了大黄对p38MAPK以及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响。结果如图2C-E所示，不同浓度大黄提取物处理后，肝癌细胞中磷酸化p38MAPK的水平显著上调，并呈浓度依赖性(P<0.05)。同时大黄提取物显著上调促凋亡蛋白Bax的表达水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，上调Bax/Bcl-2的比值(P<0.05)。以上结果提示大黄提取物可能通过激活p38MAPK信号通路诱导肝癌细胞凋亡发挥抑癌作用。
2.3 抑制p38MAPK减弱大黄提取物对肝癌细胞的抑制作用
为了进一步明确大黄提取物对肝癌细胞的抑制作用是否通过p38MAPK信号通路调节，我们对HepG2肝癌细胞分别给予大黄提取物(40 μg/mL)单独处理、p38MAPK抑制剂SB203580(10 μM)、大黄提取物(40 μg/mL)与p38MAPK抑制剂SB203580(10 μM)共处理。如图3A所示，Western blot结果显示与p38MAPK抑制剂共处理可抑制大黄提取物诱导的p38MAPK激活，降低大黄提取物上调的Bax/Bcl-2的比值(P<0.05)。MTS检测则证明，与SB203580共同处理部分减弱了大黄提取物对肝癌细胞活力的抑制作用。以上结果提示抑制p38MAPK能部分减弱大黄提取物对肝癌细胞的抑制作用。
中医认为湿热瘀毒郁结是肝癌发病的病机之一[7]。《素问》曰：“诸腹胀大皆属于热。” 大黄具有清热解毒、凉血祛瘀、泻下攻积的作用，从古至今被广泛用于治疗胃肠道和肝胆疾病。现代药理学研究发现大黄具有多种药理作用，包括促泻、保肝、抗病毒、抗菌和抗肿瘤作用[8-9]。临床研究发现多种含有大黄的经典复方，如大黄虫丸、加味茵陈蒿汤、鳖甲煎丸都有治疗肝癌的作用[10-12]。实验研究发现大黄能够抑制二乙酰基胺诱导的自发性肝癌模型大鼠的甲胎蛋白水平，抑制转氨酶升高并提高白蛋白、球蛋白水平，发挥保肝与抗肿瘤作用[13]。本研究结果显示大黄提取物能够浓度依赖性地抑制HepG2肝癌细胞活性，降低肝癌细胞存活率。
图1 大黄提取物抑制肝癌细胞活性与存活 A：HepG2肝癌细胞在用不同浓度的大黄提取物处理24 h后，进行MTS测定评估大黄提取物对细胞活性的影响；
B：10、20、40 μg/mL大黄提取物处理后肝癌细胞平板克隆形成图；
C：大黄提取物处理24 h后，活/死细胞染色图(拍摄倍数：100×)；
D：活/死细胞比值。与对照组相比较，*P<0.05
图2 大黄提取物激活肝癌细胞ROS-p38MAPK信号通路和促进凋亡相关蛋白表达 A：凋亡细胞Hoechst染色明亮，细胞核可见皱缩和碎片化的 DNA(拍摄倍数：100×)；
B：凋亡细胞比值；
C：Western blot检测大黄提取物对肝癌细胞内p38MAPK、p-p38MAPK、Bax以及Bcl-2的蛋白表达水平的影响；
D：p-p38MAPK相对表达水平；
E：Bax/Bcl-2的比值。与对照组相比较，*P<0.05
图3 抑制p38MAPK对大黄提取物抗肝癌作用的影响 A：肝癌细胞内p38MAPK、p-p38MAPK、Bax以及Bcl-2的蛋白表达水平的变化；
B：p-p38MAPK相对表达水平；
C：Bax/Bcl-2的比值；
D：肝癌细胞活力。与对照组相比较，*P<0.05；
与大黄提取物组相比较，#P<0.05。
细胞凋亡是一种以细胞核凝聚和染色体DNA片段化为特征的生物过程，对于细胞生长过程中稳态的发展和维持至关重要[14]。细胞凋亡的失衡与肿瘤的产生、发展和预后密切相关，诱导肿瘤细胞凋亡是最重要的抗癌机制之一[15]。多种化疗和靶向药物具有诱导肝癌细胞凋亡作用，如索拉菲尼能够通过诱导线粒体功能障碍和降低细胞ATP水平促进肝癌细胞凋亡来抑制肝癌生长[16]。现代药理学研究也表明大黄含多种有效成分，具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。大黄素甲醚通过激活AMPK信号通路触发肝癌细胞中的内质网应激诱导细胞凋亡[17]。大黄素通过调节MAPK、PI3K/Akt信号通路激活线粒体、死亡受体途径，促进肝癌细胞凋亡[18]。本研究使用Hochest33342/PI染色观察大黄提取物对HepG2肝癌细胞凋亡的影响，结果显示，大黄提取物处理24 h后，可以观察到肝癌细胞出现染色质皱缩以及DNA碎片、凋亡小体的形成。Western blot结果进一步表明大黄提取物能够减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达以及增加促凋亡蛋白Bax的表达，促进肝癌细胞凋亡。
p38MAPK 信号通路是细胞对各种细胞外刺激反应的主要传感通路之一，能将细胞外刺激转化为增殖、分化与凋亡等细胞反应，在包括肝癌在内的多种肿瘤发生发展中发挥重要作用[19]。研究发现多种中药提取物或有效成分能够激活p38 MAPK 信号通路促进肿瘤细胞凋亡。Cao[20]等发现银杏叶提取物通过激活p38MAPK介导线粒体和死亡受体途径诱导肿瘤细胞凋亡。Chen[21]等发现厚朴酚通过激活p38MAPK触发半胱天冬酶介导的细胞凋亡发挥抑制肿瘤细胞作用。本研究结果提示大黄提取物对肝癌细胞的抑制作用可能通过p38 MAPK凋亡途径发挥，大黄提取物刺激显著激活p38MAPK，增加HepG2细胞中促凋亡蛋白Bax的水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2 的水平，使用p38MAPK抑制剂能够部分减弱大黄提取物的抗肝癌作用。研究发现大黄内的多种有效成分也具有激活p38MAPK作用，如芦荟大黄素能够激活p38MAPK信号通路抑制血管生成与细胞迁移[22]，大黄素通过激活ROS/p38/p53/Puma信号通路诱导结肠癌细胞凋亡[23]。这些成分可能是大黄激活p38MAPK的物质基础。
综上所述，大黄提取物通过激活p38MAPK信号通路，促进肝癌细胞凋亡发挥抑制肝癌作用。
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