银霞，童彤，肖扬波，黄静，包小村，刘淑娟，吴文亮，王阔飞，伍崇岳，刘仲华*，张曙光*
1. 湖南省农业科学院茶叶研究所，农业农村部湖南茶树及茶叶加工科学观测实验站，湖南 长沙 410125；
2. 湖南省农业科学院农业装备研究所，湖南 长沙 410125；
3. 湖南农业大学茶学教育部重点实验室，国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；
4. 湖南省红茶产业发展促进会，湖南 长沙 410005
茶叶是一种特殊食品，色、香、味、形等感官品质是决定其品质优次的关键要素。目前，茶叶的感官审评主要依据标准中感官品质的文字描述和检验人员的经验，缺乏客观实物的比对，产品品质的鉴定较难把握。为了客观、准确地鉴别茶叶品质，实物标准样不可或缺[1-3]。早在计划经济时期，西湖龙井生产方就组织有关专家进行标准样的制作[4]；
武夷岩茶目前已开展了6次国家实物标准样复制工作[5]。
湖南红茶始创于1854年，1891—1916年，湖南红茶年产80万担，1915年超过100万担，主产县有新化、安化、石门、桃源、平江等。1993年，湖南红茶出口4.6万t，占全国红茶出口量的50%以上。近年来，湖南省委、省政府重点推进全省资源整合，打造“湖南红茶”公用品牌，并明确提出“花蜜香、甘鲜味”湖南红茶感官品质特征要求[6-8]。2019年，受湖南省农业农村厅委托，湖南省茶叶研究所进行了首次湖南红茶标准体系建设和湖南红茶标准样制作，有效地推动了湖南红茶品质整体水平的提高。为进一步推动湖南红茶质量提升，推动湖南茶产业发展，在第一次标准样制作基础上，2021年启动了湖南红茶实物标准样第二次制备工作，标准样来源涵盖常德、娄底、邵阳、株洲、怀化、永州、郴州、湘西等 8个市州的20家“湖南红茶”授牌企业。本文对本次实物标准样制作过程进行介绍，对所制标准样进行品质成分分析，旨在为湖南红茶生产提供参考。
1.1 试验材料与试剂
1.1.1 试验材料
标准样来源：芽头红茶3个、一芽一叶红茶7个、一芽一二叶红茶2个，一芽二叶红茶5个，均为 2021年春茶，由湖南红茶企业提供，经审评合格后选用（表1）。
表1 标准样样品及来源企业信息Table 1 Standard sample and company information
1.1.2 试剂
福林酚、蒽酮、Na2CO3、乙酸乙酯、浓硫酸均为国产分析纯，试验用水为华润怡宝饮料（中国）有限公司瓶装水。
1.2 仪器与设备
e2695型高效液相色谱仪，美国 Waters公司；
紫外分光光度计，日本岛津公司；
AE240型电子天平，瑞士Mettler公司；
101-3AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；
DK-S28型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；
7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪、HP5-MS色谱柱、25 μL微量进样器，美国 Agilent公司；
65 μm手动 SPME进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，美国Supelco公司；
磁力搅拌加热台，美国Troemner公司。
1.3 试验方法
1.3.1 茶叶感官审评方法
由 7位持有国家职业资格证书的评茶员组成评审小组，参照GB/T 23776—2018中红茶审评方法进行审评。
1.3.2 生化成分检测
水浸出物含量测定参照 GB/T 8305—2013，茶多酚含量测定参照 GB/T 8313—2018，茶黄素测定参照GB/T 30483—2013。
1.3.3 挥发性成分检测分析
通过顶空固相微萃取结合气相质谱（HS-SPME-GC-MS）技术对红茶香气成分进行检测分析，HS-SPME参数参照文献[7]。
GC-MS 条件：HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）毛细血管柱，载气为99.999%氦气，载气流速为 1.7 mL·min-1，进样口温度为250℃，不分流进样；
升温程序为初始温度50℃，保持2 min，以1℃·min-1升温至60℃，保持2 min，以2℃·min-1升温至104℃，保持1 min，以 5℃·min-1升温至 150℃，保持 1 min，以 15℃·min-1升温至 220℃，保持 5 min；
四极杆温度为150℃，离子源温度为230℃，离子源为 EI源，电子能量为 70 eV，电离电压为1 540 mV，扫描范围33～400m/z。
定性分析：将原始数据导入 Qualitative Analysis B.07.00软件进行处理，导入 NIST 2017谱库进行匹配，以匹配度大于 750和保留指数偏差小于10为标准，对挥发性成分进行鉴定。
定量分析：采用内标法进行半定量分析，内标为 10 μL 8.68 μg·mL-1的癸酸乙酯。
1.4 试验数据处理与分析
通过Office Excel 2019对数据进行统计分析，SPSS 22.0软件进行显著性分析，Origin 2021软件进行数据归一化处理，Simca 14.1软件进行PCA和载荷图分析，Prism 8软件进行热图和柱状图分析。
湖南红茶实物标准样是监督检验产品感官品质和企业产品检验分级的依据，为保证湖南红茶品质的稳定性和代表性，湖南红茶实物标准样制作的主要流程为标准样备选样源收集→样品整理与适拼样筛选→对标试拼小样→实物标准样的确定→拼大样→装袋封样保存。
2.1 标准样备选样源收集
根据区域、海拔、品种分布，筛选20家“湖南红茶”授牌企业，每个企业收集芽头、一芽一叶和一芽二叶 3个等级原料的红茶产品，作为标准样备选样源。
2.2 样品整理与适拼样筛选
根据 GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》，对所有样品进行整体密码审评，对其品质进行准确判断和把握，形成完整的拼配原料资源库。资源库具体分类分别根据干茶颜色、光泽程度对原料进行分类编号；
根据茶叶外形品质、整体老嫩程度、锋苗情况进行分类编号；
根据茶叶条索大小对原料进行分类（特级、一级、二级），再通过开汤评审，综合香气、滋味、汤色整体情况对原料综合内质进行分类编号。剔除不符合拼配标准的茶样，对可用于拼配的样品进行预拼等级筛选。
2.3 对标试拼小样
2.3.1 明确标准
对照湖南红茶产品标准T/HNTI 02—2019[9]（表2），根据用于拼配样品原料的品质现状，进行以外形品质为主的特级、一级和二级湖南红茶小样试拼配。
表2 湖南红茶感官品质要求Table 2 Sensory quality requirements of Hunan black tea
2.3.2 筛选基准茶和调剂茶
在明确标准的基础上，筛选出合适的基准茶和调剂茶，从而凸显湖南红茶的特性。基准茶是标准样制作的主体，其品质需要略高于所拼等级，在外质和内质上综合品质较优，但在某些品质因子（如色泽、香气等）上表现稍差；
调剂茶用于对基准茶的缺陷进行调节，将拼配样品质稳定在相应等级。
前期研究结果表明，区域和品种是影响茶叶品质的重要因子[8]。整体来看，常德、湘西、娄底等湘中以北地区高海拔茶园较多，茶叶样品芽叶较小，嫩甜香显，滋味甜醇，适合特级或一级标准样拼配；
而邵阳、株洲、永州、郴州等地气温相对偏高，样品芽叶相对较大，花香较浓，适合一级或二级标准样拼配。
制作湖南红茶的茶树品种主要包括湖南主推良种和群体种。对湖南目前种植面积较大的几个茶树品种所制红茶品质进行比较发现，槠叶齐所制红茶在滋味品质上表现优秀，鲜、浓、爽，而黄金茶1号所制红茶香气表现良好，香气甜醇带鲜[8]。因此槠叶齐和黄金茶1号所制红茶适合作为标准样品的基准茶；
金观音和部分群体种所制红茶花香浓郁，适合做标准样的调剂茶。
2.4 实物标准样的确定、拼大样
前期大量的感官审评和分析发现，品种因素对红茶品质影响大于产区因素[8]，因此在原料选用时，优先考虑品种，其次考虑产区。在确定各等级小样的配方后，根据小样试拼小堆样，品质与标准样符合后，再拼大堆样。本次湖南红茶标准样的拼配方案如表3所示。
表3 各等级湖南红茶标准样拼配方案Table 3 Blending scheme of standard samples of different grades of Hunan black tea
2.5 装袋封样保存
大堆样充分匀堆后，检取大堆样品与标准小样复核，经专家感官审评品质完全符合后，可装袋封签。标准实物样袋外粘贴明显标签，注明实物标准样名称、日期、等级。
3.1 感官品质特点
本次所制湖南红茶不同级别实物标准样干茶、汤色和叶底如图1所示。经感官审评，特级红茶标准样条索紧细显锋苗、金毫显、匀净、色泽乌润，汤色红亮，香气鲜嫩甜香、高长，滋味甜醇甘鲜，叶底细嫩显芽、红匀亮；
一级红茶标准样条索较紧细有锋苗、有金毫、较匀齐、色泽乌润，汤色红亮，香气甜香尚高长，滋味醇厚，叶底嫩匀有芽、红亮；
二级红茶标准样条索紧结、有金毫、较匀齐、色泽较乌润，汤色红明，香气甜香带花香、较持久，滋味甜醇尚浓，叶底较嫩匀、较亮。
图1 不同等级湖南红茶标准样Fig. 1 Standard samples of different grades of Hunan black tea
3.2 滋味成分
对各等级实物标准样进行含水量、水浸出物、氨基酸、茶多酚和茶黄素的成分检测，结果如表4所示。其中，含水量、水浸出物、茶多酚 3个品质指标为标准 T/HNTI 02—2019指定检测指标，实物标准样的检测结果均符合标准。此外，氨基酸在各等级间具有较为显著的区间分层，随等级下降，氨基酸呈下降趋势，即含量与等级呈正相关。
表4 各等级湖南红茶标准样理化指标分析Table 4 Physical and chemical index analysis of standard Hunan black tea samples of different grades%
进一步分析发现，特级湖南红茶标准样的氨基酸含量最高，其茶样鲜味突出；
一级湖南红茶标准样水浸出物和儿茶素含量较高，呈现出甘爽的口感；
二级湖南红茶标准样茶多酚、儿茶素、氨基酸和咖啡碱含量均较低，滋味表现为甜醇尚浓。
3.3 香气物质
对各等级实物标准样进行挥发性成分检测，共鉴定出114种挥发性成分，特级、一级和二级湖南红茶标准样中分别检测出110种、114种和109种物质。与一级湖南红茶标准样相比，特级湖南红茶标准样中未检测到α-亚乙基-苯乙醛、醇酯-12、β-石竹烯和α-依兰油醇，二级湖南红茶标准样中未检测到二甲基二硫醚、顺式-4-庚烯醛、α-雪松烯、β-石竹烯和α-依兰油烯。
对 3个等级湖南红茶标准样挥发性成分进行半定量分析，结果表明，3个等级样品区分度良好（图2）。其中特级湖南红茶标准样的总挥发性物质含量最高，为 53 348 μg·kg-1，一级和二级湖南红茶标准样分别为 42 676 μg·kg-1和37 120 μg·kg-1（图3-A）。进一步分析发现，醇类、醛类、酯类3种物质在样品中含量较高（图3-B），其中醇类物质在 3种茶样中含量占比均为最高，其次是醛类物质和酯类物质。
图2 不同等级湖南红茶挥发性成分PCA分析Fig. 2 PCA analysis of volatile components of different grades of Hunan black tea
图3 不同等级湖南红茶挥发性成分含量分析Fig. 3 Analysis of the volatile contents of different grades of Hunan black tea
进一步对 3个等级湖南红茶标准样的挥发性成分占比进行热图分析（图4），结果表明，特级湖南红茶标准样挥发性萜类物质含量高于一级和二级湖南红茶标准样，二级湖南红茶标准样中来源于脂肪酸和类胡萝卜素的挥发性物质含量高于其他标准样[10-11]。分析发现，挥发性萜类物质是茶叶香气的重要贡献成分[12]，芳樟醇和香叶醇等呈现出优雅的香气，与特级湖南红茶标准样嫩甜香高长持久的审评结果一致；
类胡萝卜素降解产物大多在水中有很低的阈值和特殊香气，如α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮和橙花叔醇等具有愉悦的花香[13]，与二级湖南红茶标准样带花香的审评结果一致。进一步对3个等级湖南红茶标准样的挥发性香气成分进行香气活性值（Odor activity value，OAV）分析，结果发现 OAV≥1的香气成分有 36种，其中 1≤OAV＜10的有 13种，10≤OAV＜100的有 14种，OAV≥100的有9种（表5，图5）。结合载荷图（图6）可知，β-大马烯酮（玫瑰香[14]）、芳樟醇（花香[15]）和香叶醇（蜜香[15]）等是特级湖南红茶标准样的关键香气物质；
苯甲醛（坚果香[16]）、苯乙醛（甜香[14-15]）和正癸醛（甜香贡献成分[17]）是一级湖南红茶标准样的关键香气物质；
呋喃型芳樟醇氧化物（花香[15]）、β-紫罗兰酮（花香[15]）和α-紫罗兰酮（花香[15]）等是二级湖南红茶标准样的关键香气物质。
图4 不同等级湖南红茶挥发性成分热图分析Fig. 4 Heat map analysis of volatile components of different grades of Hunan black tea
表5 不同等级湖南红茶香气贡献成分（OAV≥1）Table 5 Aroma components of different grades of Hunan black tea (OAV≥1)
图5 不同等级湖南红茶OAV≥100的香气贡献物质含量Fig. 5 Content of aroma contributing substances for different grades of Hunan black tea with OAV≥100
图6 不同等级湖南红茶挥发性成分载荷图分析Fig. 6 Biplot analysis of volatile components of different grades of Hunan black tea
湖南红茶实物标准样制作以凸显“花蜜香、甘鲜味”品质特点为原则，兼顾品种和区域两个主要因素，筛选出合适的基准茶和调剂茶。本次标准样选用的品种为槠叶齐、黄金茶1号、地方群体种和金观音。槠叶齐为国家级良种，其内含物丰富，水浸出物、茶多酚、茶黄素含量高，所制红茶滋味浓强回甘，甜香浓[18-19]；
黄金茶 1号氨基酸含量高，所制红茶甘鲜甜醇，带花香[20-23]；
金观音是从铁观音与黄金桂人工杂交后代中选育而成，制成工夫红茶花香浓，滋味鲜醇有回甘[24-27]。拼配时，根据“花蜜香、甘鲜味”品质要求，采用“扬长避短、显优隐次、高低平衡”的拼配技术要领，在明确产区和品种差异基础上，确定拼配原料。选用湖南省良种和群体种的芽头及初展的一芽一叶所制红茶作为特级湖南红茶拼配原料，凸显“甘鲜味”品质特点；
选用湖南省良种和群体种一芽一叶所制红茶作为一级湖南红茶拼配原料，凸显甜香、醇厚的品质特点；
二级湖南红茶选用金观音所制红茶为拼配原料，显著提高了湖南红茶的香气，呈现花蜜香的品质风味。
本次所制湖南红茶实物标准样均符合T/HNTI 02—2019标准。特级条索紧细，色泽乌润，汤色红亮，鲜嫩甜香，滋味甜醇甘鲜，叶底细嫩红亮；
一级条索较紧细，色泽乌润，汤色红亮，甜香，滋味醇厚，叶底嫩匀红亮；
二级条索紧结，色泽较乌润，汤色红明，甜香带花香，滋味甜醇尚浓，叶底较嫩匀、较亮。生化成分和香气物质分析表明，特级湖南红茶标准样氨基酸含量显著高于其他等级湖南红茶标准样，与卢丹敏等[28]研究结果一致；
香气上主要表现为嫩甜香高长，其挥发性萜类物质含量高于一级和二级湖南红茶标准样，进一步分析发现，β-大马烯酮、芳樟醇和香叶醇等是特级标准样的关键香气物质，与 Yin等[29]研究结果一致。一级湖南红茶标准样水浸出物和儿茶素含量高，香气物质种类最多，但花香型的萜烯类挥发性物质占比低于特级湖南红茶标准样，花果香型的酯类物质占比低于二级湖南红茶标准样，苯甲醛、苯乙醛和正癸醛是一级湖南红茶标准样的关键香气物质，与Li等[17]研究结果相似，也与生产实践中一级红茶大多呈甜香的现象一致。二级湖南红茶标准样生化成分含量相对较低，表现为滋味甜醇尚浓，与卢丹敏等[28]研究结果一致；
来源于脂肪酸和类胡萝卜素的香气物质含量显著高于其他等级湖南红茶标准样，芳樟醇氧化物、α-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮等是二级湖南红茶标准样的关键香气物质。值得注意的是，二级湖南红茶标准样的酯类物质占比虽显著高于其他等级，但总含量并不高，可能与本研究采用的HS-SPME的前处理方法有关。该方法使用的针头对酯类等高沸点物质吸附效果较差，从而造成检测含量大大低于实际值，下一步可考虑采用搅拌棒吸附萃取（Stir bar sorptive extraction，SBSE）等其他前处理方法来进一步探究酯类物质的含量。
标准样的制定以指导生产为目的。本次制定的实物标准样品质略高于目前湖南红茶的平均水平，以期通过标准样的使用助推湖南红茶的整体加工水平的提高。此外，本次制定的实物标准样选用的原料主要来自湖南省主栽品种，目前湖南省大部分企业已具备品种原料基础，下一步可通过工艺改进，或少数企业通过品种更新，最终实现湖南红茶“花蜜香、甘鲜味”的品质要求。
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