程芳，李强，王静林，张玉 ，黎纬明，曾芳
(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院药学部，武汉 430022；
2.湖北省重大疾病精准用药医学研究中心，武汉 430022；
3.华中科技大学同济医学院附属协和医院血液科，武汉 430022)
达沙替尼是靶向于BCR-ABL的第2代酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，临床主要用于治疗对于伊马替尼耐药或不耐受的费城染色体阳性的慢性髓细胞白血病(CML)慢性期、加速期和急变期的成年患者[1]，常见的不良反应包括体液潴留(胸腔积液)、皮疹、骨骼疼痛和腹泻等[2]。
达沙替尼在连续给药28 d后达到稳态，达沙替尼峰浓度(服药后2 h的血药浓度，Cmax)与其药-时曲线下面积(AUC)密切相关，可用于预测患者疗效[3]。前期研究常选择测定谷浓度(C0)和Cmax来预测达沙替尼的治疗效果[4]。达沙替尼血药浓度具有明显的个体内和个体间的差异，且与临床疗效密切相关[5]。研究表明服用同等剂量(100 mg，qd) 达沙替尼的患者中C0和Cmax的差异较大，在中国人群中达沙替尼的体内暴露量和半衰期等明显高于服用同等剂量的欧美人群[6-7]，提示达沙替尼的药动学过程可能与基因和种族等因素密切相关。同时食物以及合并用药也会影响达沙替尼的血药浓度[8]。因此服用达沙替尼治疗的患者，建议定期进行药物浓度监测，对提高临床疗效和降低其不良反应具有重要意义。
根据欧洲白血病网的建议，应在接受TKI治疗3，6和12个月后评估CML患者的临床治疗效果。对于在3个月内未获得满意疗效的患者，建议考虑监测TKI血药浓度。在针对CML患者的TKI治疗中，治疗药物监测是剂量优化方法，以期获得更快，更有效的临床治疗新策略。本研究旨在运用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)，建立一种稳定性好、通用性强、灵敏度高、检测下限低、能够满足临床患者血浆中达沙替尼浓度的检测方法，为后续血药浓度与临床疗效的关系、药动学及体内外代谢相关研究提供方法学支撑。
1.1仪器 三重四极杆质谱仪(型号：API4000+，美国AB SCIEX公司)；
超高压液相色谱仪(型号：ACQuity H，美国Waters 公司)；
低温高速离心机(型号：5804R，德国Eppendorf公司)；
涡旋混合器(型号：Vortex-5，海门市其林贝尔仪器厂)；
十万分之一电子分析天平(型号：AB135-S，瑞士梅特勒-托利多公司)。
1.2试剂 达沙替尼标准品(批号：19-SEP-19-00，含量：99.4%，加拿大TRC公司)；
伊马替尼-D8内标(批号：I267987，含量：98.4%，加拿大TRC公司)；
甲酸铵(批号：173132，含量：99%，美国Sigma公司)；
乙腈、甲醇溶液(色谱级，美国TEDIA公司)。
2.1方法
2.1.1液相色谱条件 色谱柱为Luna®C18柱(2.0 mm×20 mm，3 μm)；
流动相：A相为含0.1%甲酸的10 mmol·L-1甲酸铵缓冲液，B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱方式，洗脱程序见表1；
流速：0.6 mL·min-1；
柱温35 ℃；
进样量：10 μL。
表1 梯度洗脱程序 Tab.1 The determination gradient elution conditions
2.1.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；
干燥温度：500 ℃；
喷雾电压：5500 V；
离子源气体1(N1)与气体2(N2)压力均为55 psi；
气帘气压力为25 psi；
扫描方式为多反应监测(MRM)，待测物及内标的其他检测参数见表2。
表2 待测物及内标的质谱检测参数 Tab.2 Mass spectrometric parameters of analytes and internal standards
2.1.3储备液及工作液的配制 精密称取达沙替尼10 mg，用甲醇-水(V/V=1：1)溶解达沙替尼，称取伊马替尼-D81 mg，用纯甲醇溶解伊马替尼-D8，然后分别定容至10 mL，摇匀，即得到1 mg·mL-1达沙替尼标准品储存液，以及0.1 mg·mL-1伊马替尼-D8内标储存液，4 ℃避光保存。
取达沙替尼对照品储存液适量，甲醇-水(V/V=1：1)稀释至相应浓度(10，5，2.5，1，0.5，0.1，0.05，0.01 μg·mL-1) ，质控低浓度(0.025 μg·mL-1)、中(1.0 μg·mL-1) 、高(8.0 μg·mL-1) 。
2.1.4标准曲线及质控血浆样品的制备 180 μL空白血浆中分别加入20 μL达沙替尼工作液，配制标准曲线和质控对照品，标准曲线浓度范围为1，5，10，50，100，250，500，1000 ng·mL-1；
质控对照品低浓度(2.5 ng·mL-1) 、中浓度(100 ng·mL-1) 、高浓度(800 ng·mL-1)，定量下限(1 ng·mL-1)。
2.1.5样品前处理 精密吸取血浆样品180 μL，依次加入内标储存液20 μL，甲醇800 μL除蛋白，涡旋混合均匀，在10 625×g相对离心力下离心10 min，取上清液上样分析，进样量10 μL。
2.1.6临床应用 收集华中科技大学同济医学院附属协和医院2020年5月—2022年1月服用达沙替尼治疗的CML患者血浆标本共30例。该研究已通过华中科技大学同济医学院附属协和医院伦理委员会的审批([2021]伦理字(0784))，纳入研究的患者均自愿签署知情同意书。所有患者接受口服达沙替尼治疗，每次100 mg，一天一次。达沙替尼在连续治疗28 d后血药浓度达稳态，给药2 h后血药浓度达到峰值。服用达沙替尼的患者需要同时测定谷浓度和峰浓度用来评估疗效与不良反应。患者服用达沙替尼达稳态后，在下一次服药前空腹采血2～5 mL，此时的浓度为谷浓度；
服药2 h后再一次采血2～5 mL，这时的浓度为峰浓度。血样置于乙二胺四醋酸(EDTA)抗凝管中，离心取上清液进行HPLC-MS/MS 法检测。
2.2结果
2.2.1方法专属性考察 达沙替尼和伊马替尼-D8的保留时间分别为1.99和1.93 min，空白血浆不干扰达沙替尼和内标物质的测定。色谱图见图1。
A.空白血浆；
B.定量下限的标准血浆样品；
C.服用达沙替尼患者的稳态谷浓度血浆样本。图1 达沙替尼典型质谱图 A.blank plasma；
B.standard plasma at the limit of quantitation；
C.plasma sample at steady state of patients receiving dasatinib.Fig.1 Typical mass spectrum of nilotinib and dasatinib
2.2.2标准曲线与线性范围 取达沙替尼的标准曲线混合血浆样品上样，达沙替尼与内标的峰面积比(Y)分别对血浆中的浓度进行加权线性回归，权重系数为1/X2，绘制标准曲线，得到标准曲线方程为：Y=0.000 561X+0.000 174，r2=0.997 4，结果表明达沙替尼血药浓度在1～1000 ng·mL-1的范围内线性关系良好，定量下限为1 ng·mL-1。
2.2.3准确度和精密度 取达沙替尼定量下限(1 ng·mL-1) 、低(2.5 ng·mL-1) 、中(100 ng·mL-1) 、高(800 ng·mL-1)质控4个浓度的血浆样品，每一样品配制6份，同一天内上样，分别计算准确度，日内精密度，连续测定3 d，计算日间精密度。精密度以相对标准偏差(relative standard deviation，RSD) 表示，准确度以样品测定均值对理论值的相对偏差(RE)表示。结果见表3。
表3 达沙替尼测定方法的准确度与精密度 Tab.3 Accuracy and precision of determination for dasatinib
2.2.4提取回收率 分别配制低、中、高质控样品各6份，上样分析记录峰面积为A1，另外取6份空白血浆，甲醇提取后分别再加入达沙替尼以及内标质控对照品，上样分析记录峰面积为A2，提取回收率(%)= A1/A2× 100%。结果见表4。
表4 达沙替尼提取回收率与基质效应 Tab.4 Extraction recovery and matrix effect of dasatinib
2.2.5基质效应 取6例不同患者的空白血浆各180 μL，分别加入适量的达沙替尼制备低、中、高3个浓度的样品，上样分析记录峰面积为A3。取180 μL的超纯水，相同处理后直接进样，峰面积为A4。基质效应= A3/A4×100%。结果表明血浆对达沙替尼的测定没有干扰影响，结果见表4。
2.2.6残留效应 本实验进一步考察了进样高浓度样品后的残留问题，计算进样高浓度点后的残留峰面积与标准曲线最低浓度点峰面积的比值。结果表明达沙替尼残留为0.08%，残留分析物不影响检测的准确度和精密度。
2.2.7稳定性 本实验考察了达沙替尼质控品在室温放置24 h；
-20 ℃冻融3次；
以及4 ℃避光放置3 d的稳定性，结果见表5。结果表明该方法具有很好的稳定性。
表5 达沙替尼稳定性考察结果 Tab.5 Stability inspection results of dasatinib
2.2.8临床应用 分别收集本院30例服用达沙替尼的CML患者进行峰浓度与谷浓度测定。达沙替尼谷浓度为4.75(0.85～35.8)ng·mL-1，峰浓度为168.8(75.3 ～583.6)ng·mL-1。由此可见，笔者在本实验建立的HPLC-MS/MS 法能满足临床对达沙替尼血药浓度检测的需求。
之前报道的达沙替尼血药浓度测定方法普遍存在灵敏度低、样本前处理复杂、样本分析时间长等弊端，而且检测下限过高，无法满足临床需求[9-10]。本研究结合国内外推荐的药物有效治疗窗，设置合理的浓度范围，采用HPLC-MS/MS法检测人血浆中达沙替尼的药物浓度，前处理采用甲醇沉淀，高速离心的方法除蛋白，方法简单，出峰时间短。由于结构相似，保留时间接近，该方法采用伊马替尼-D8作为内标进行定量，提取回收率和基质效应试验结果均说明伊马替尼-D8可以最大限度避免基质效应。该方法检测灵敏度高、检测限低，可满足临床对于达沙替尼血药浓度检测的需求。
目前TKI类药物浓度监测在临床上仍处于起步阶段，但现有证据表明，基于药物动力学参数的剂量调整对大多数接受TKI治疗的CML患者有益[11]。研究表明每日剂量为100 mg的患者C0和Cmax的变异系数(CV)值分别为26%和56%[12]，说明达沙替尼Cmax的个体间差异较大。CML患者主要的细胞遗传学反应(CCyR)与达沙替尼平均稳态血浆浓度显着相关[13]，胸腔积液发生率与达沙替尼C0显著相关(危险比为1.22)[14]。对于达沙替尼，建议每天服用一次，维持较高的Cmax(≥50 ng·mL-1)可以获得良好的临床治疗效果[15]，而较低的C0(<2.5 ng·mL-1)可以避免胸腔积液。本实验结果发现服用达沙替尼的中国CML患者血药浓度个体差异性大，结合部分患者的临床疗效也发现谷浓度较高的患者更易发生不良反应，但是需要扩大样本量进一步深入研究。
本研究建立的达沙替尼血药浓度检测方法最大特点在于前处理操作简便，采用同位素内标避免基质效应，检测范围合理，可满足临床大样本检测以及药动学分析要求。本方法为后续进一步研究达沙替尼血药浓度与临床疗效和不良反应的关系提供了很好的方法学支撑。
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