繁萍，魏聪聪，李茹，骆寅梅，张瑞强
(青海大学 农牧学院，青海 西宁 810016)
青海省是我国少数以生态立省的省份[1]，因其区域地理环境特点，担负着我国乃至亚洲的主要地理与生态安全屏障功能[2，3]。青海省内不仅已经建成和在建多个国家公园，而且也发展了国内最大的天然有机牧场[4]，有机畜牧业已经成为当地的支柱产业。以牧草为主要食物的放牧动物，从原生牧草逐步更替为退化草场，再逐步发展为有机牧场的变化过程中，极有可能带动消化道微生物多样性发生变化。已有的一些相对广泛的研究报道，多集中于单一种类动物，如藏羊[5]或牦牛[6，7]等，而对于同一牧场区域内的不同放牧动物间的比较研究少见。此外，尽管认为有机牧场良性发展有利于促进畜牧业健康及提高畜产品质量，但是食物品质的变化对微生物的影响并不能以推测为依据。基于此，本论文采用宏基因组测序方法，对来自青海祁连县的藏羊和牦牛的新鲜粪便样本进行了物种多样性的比较分析。
1.1样本 2020年8月采自青海祁连县境内牧场内的藏羊和牦牛的新鲜粪便样本，干冰保温寄送上海美吉生物医药科技有限公司，完成宏基因组测序及物种注释。
1.2数据整理 用Excel对注释结果数据进行整理，美吉在线平台做多样性数据分析与制图。
2.1 两种粪便样本中微生物分类多样性对比
经高通量测序及序列优化后，获得的藏羊有效的物种注释序列17 343 250条，在NR库中共注释物种数10 786种。牦牛有效物种序列数19 108 126条，共注释物种数8 774种。微生物种分细菌、古菌、真核微生物与病毒四种，各自有关注释数据见表1和图1-图4。藏羊粪便中的细菌、古菌和病毒的物种数都高于牦牛，而真核微生物则相反。牦牛粪便中的细菌、古菌和真核微生物的有效物种序列数都高于藏羊，只有病毒的有效序列数相反。两种动物粪便中都有unclassfiied的物种被检出，可能物种数较小，但两种粪便间的序列数相差较大，藏羊粪便中的共有微生物序列数显著多于牦牛的共有微生物序列数(p<0.05)。两种动物粪便中的细菌差异物种序列数和病毒的共有物种序列数则是极显著的差异(P<0.01)。其它数据尽管数值上有差距，但不存在显著差异(P>0.05)。
图1 牦牛粪便微生物群落饼图
图2 藏羊粪便微生物群落饼图
图3 牦牛、藏羊粪便微生物群落对比柱状图
图4 牦牛、藏羊粪便微生物群落对比热图图
2.2 两种动物粪便中微生物各分类水平情况对比
藏羊粪便细菌79个门、130个纲、244个目、455个科、1 783个属和9 684个种，在种水平上含有297种未培养细菌种，1个未鉴定细菌种和351个其它水平未分类细菌种。古菌9个门、18个纲、30个目、47个科、115个属、342个种，在种水平上还有12种未培养古菌，9种其它水平为分类古菌。真核微生物27个门、77个纲、179个目、285个科、387个属、478个种，种水平全部为确认真核微生物。病毒有1个目、1个科、34个属、261个种，在种水平上有1种未鉴定噬菌体，还有6种未培养病毒。
牦牛粪便中细菌注释77个门、84个纲、12个目、380个科、1 488个属、8 099个种，在种水平上含有237种未培养细菌种，在其它水平上未分类菌种有294种。古菌种注释7个门、16个纲、28个目、40个科、76个属、184个种，在种水平上有3种已确定属未分类种的古菌种，以及12种未培养古菌。真核微生物注释25个门、65个纲、129个目、187个科、245个属、292个种。在门和纲水平上都有2个unclassifiede的真核微生物。病毒注释与藏羊的结果类似，没有门与纲的明确分类，有3个目、9个科、24个属、182个种。
表2中列出了两种动物粪便中的四种微生物的最优势分类。两种动物粪便中的细菌和古菌在属及以上分类的最优势生物分类一致，只有种水平不同。病毒的目和科水平也一致，但属和种有差异，这个差异仅是噬菌体的分型同。真核微生物的优势生物是区别最大的，从门到种都不同。
图5中展示了两种动物粪便中的主要共有微生物种在粪便样本中的丰度对比，图中这些注名的微生物种是共有菌种序列数较多且差异较小的种，但在各自的微生物群落结构上却展现出不同的丰度，如Comamonas_aquatica是藏羊粪便中的最优势菌，但在图5中没有显示，表明牦牛中的这种菌的序列数与丰度都低。而图中展示的Acinetobactersp.SFC是牦牛的最优势菌，在藏羊粪便中含量也不低。总体来看，图中展示的这些已注名微生物在牦牛粪便中的丰度大于在藏羊的粪便中的丰度，而others部分则是藏羊的丰度高于牦牛的丰度。
表1 两种动物粪便中的已确认物种与有效序列数据
表2 不同微生物域在不同分类水平的优势微生物
图5 两种动物粪便中微生物与功能的circos图
青海省已经建成国内最大的有机牧场，藏羊和牦牛是主要的地区放牧家畜[4]。已有的研究中多以单种动物为研究对象，如王循刚等[5]采用16S扩增测序的方法，分析了藏羊瘤胃与粪便中的细菌,厚壁菌门是粪便中丰富度最大细菌门类，结果与本研究不同。两份研究的样本均来自青海海北地区，不存在时空和食物的显著差异，最大的区别是采用的研究方法。尽管16 S扩增测序在微生物多样性分析工作中应用相对较多，但不能说明是影响结果的主要原因，而有机草场的成熟度或许是可能原因之一。在牦牛样本的结果中，变形菌门属于最优势菌门，与聂远[5]、马力等[6]的研究略有差异。他们的研究中，变形菌门属于次优势菌。
本研究还分析了两种动物粪便中的微生物群结构特点(图5和表2)，藏羊的最优势细菌Comamonas_aquatica在牦牛中丰度极低，而牦牛的最优势细菌Acinetobacter sp.SFC则是两种动物共有且序列数相对接近，这种特点可能反映出在细菌的群落结构上牦牛的多样性更丰富。比较两种动物粪便中的古菌，均为广古菌门的系列甲烷杆菌为主，仅在种水平有差异，分析可能是反刍动物消化系统古菌的基本特点[7]，也可能与同地区有关联。需要注意的是牦牛粪便中的优势病毒是一种人兽共患性寄生虫[8]，以优势种被检测到可能提示有致病的风险。
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