张凤鸿 上海中维检测技术有限公司 126707
酸枣仁皂苷来源于为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill. var.spinosa (Bunge) H u ex H. F. Chou干燥成熟的种子，具有养心补肝，宁心安神，敛汗，生津。用于虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴的功效[1]。酸枣仁合剂收录于卫生部药品标准中药成方制剂第七册，由酸枣仁、知母、茯苓、川芎和甘草五味中草药构成[2]，但由于煎煮程序复杂，因此部分药厂将这五味或是取其部分中草药或与其他中草药配伍做成特殊膳食补充剂，方便服用。其中起主要药效的是酸枣仁皂苷A，目前对于酸枣仁皂苷A的检测多是集中在单味药酸枣仁及其提取物的检测，利用HPLC[1,3,4]，以及LC-MS-MS方法[5]，然而没有对于酸枣仁合剂及复方中酸枣仁皂苷A的检测方法，本实验的主要目的是利用HPLC-ELSD建立酸枣仁合剂提取物混合片中酸枣仁皂苷A含量的测试方法。
高效液相色谱仪：安捷伦HPLC 1260-安捷伦蒸发光散射检测器380(ELSD)
电子天平：梅特勒XS205DU十万分之一天平
恒温振荡水槽：上海一恒，DKZ电热恒温振荡水槽
氮吹仪：安谱，40位
酸枣仁皂苷A ：安谱，98.8%
甲醇：
CNW，纯度：99.9%，级别：HPLC
乙腈：
J&K 纯度：99.9% 级别：ACS/HPLC
水：Merck Millipore制备的超纯水
过滤膜：安谱，0.45μm有机滤膜
样品信息：混合提取物片剂（酸枣仁提取物+知母提取物+茯苓提取物+川芎提取物+甘草提取物+辅料（麦芽糊精+玉米淀粉等）)，客户提供，配比保密。
样品空白信息：混合提取物片剂（知母提取物+茯苓提取物+川芎提取物+甘草提取物+辅料（麦芽糊精+玉米淀粉等），客户提供，配比保密。
2.1 测试条件
仪器名称：液相色谱质谱仪（安捷伦1260-蒸发光散射检测器（ELSD））
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18, 4.6×250 mm, 5μm
色谱条件：
柱温：30°C
流动相A：18MΩ超纯水
流动相B：色谱纯乙腈（ACN）
洗脱程序
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进样程序：吸取速度200μl/min，进样速度200μl/min，吸取样品量50μl，吸取水量50μl，进样环内混合10次，进样。
蒸发光散射ELSD检测器参数：
蒸发温度：90°C
雾化器温度：85°C
氮气流速：1.6 SLM
2.2 方法学验证结果
2.2.1 标准品贮备液制备
称取酸枣仁皂苷A（ANPEL，98.8%，P1860010）10.45 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度。制得浓度为1032μg/mL的标准储备液待用。
2.2.2 样品前处理
样品用食品破碎机打碎，称取1.00克于40mL玻璃瓶中，加入10mL70%的甲醇水溶液，混匀后，旋紧螺纹盖密封，置于85°C水浴中加热并振荡2h。加热完毕后，冷却至室温。精确取1.00mL样品溶液于氮吹管中，50°C吹至近干，精确加入1.00mL甲醇复溶，过0.45μm有机滤膜，50μL程序进样，HPLC-ELSD分析。
2.2.3 系统适用性
取酸枣仁皂苷A 20 μg/mL线性低点溶液，进样分析，评价其理论塔板数为74459,结果详见表6。
2.2.4 线性关系试验
标准曲线溶液配制与测试：分别用微量移液器，移取19.3μL、38.8μL、58.1μL、79.5μL、96.9μL酸枣仁皂苷A标准储备溶液（1032μg/mL），加入相应体积的甲醇，得到1mL的标准曲线溶液，混匀后，进样分析。以面积的对数与含量的对数拟合直线方程，得Y= 0.6124★X - 0.1448，相关系数R² = 0.9971。
检测结果见下表1。
2.2.5 重复性试验
A：方法精密度：按照“2.2.2样品前处理”进行样品制备，独立制备6份，计算6次独立制备样品的重复性RSD%。
B: 仪器精密度：取酸枣仁皂苷A标准溶液100 μg/mL溶液，进样6次，计算酸枣仁皂苷A面积的RSD%。
试验结果见表2。
2.2.6 加标回收率试验（准确度）
样品制备：样品制备同“2.3.2样品前处理”
加标样品制备：称取1.00克于40mL玻璃瓶中，独立称取9份，分别按照酸枣仁皂苷A理论含量0.027%进行约0.5倍、1倍、1.5倍的加标，每个水平三份样品，然后按照“2.3.2样品前处理”。具体加标浓度及结果见下表3。
2.2.7 检出限与定量限试验
取酸枣仁皂苷A低点浓度溶液（20μg/mL），用上述仪器方法进行HPLC-ELSD分析，在保留时间处截取一段基线，以目标物峰的响应与杂质的响应求算信噪比（S/N），以此S/N之值线性推算检出限与定量限。
取酸枣仁皂苷A 20μg/mL浓度溶液，用甲醇进行1:1稀释，得到10μg/mL酸枣仁皂苷A标准溶液，进样分析后，实际S/N=13.8。取酸枣仁皂苷A 10μg/mL浓度溶液，用甲醇进行1:1稀释，得到5 μg/mL酸枣仁皂苷A标准溶液，进样分析后，实际S/N=3.7。
检测结果见表4。
因此，结合实际逐级稀释后的实验结果，检测限：酸枣仁皂苷A仪器检出限为5ug/mL，对应的样品浓度为50mg/kg（0.005%），酸枣仁皂苷A的定量限为10ug/mL，对应的样品浓度为100 mg/kg（0.010%）。
2.2.8 专属性试验
样品空白制备：称取1.00克的样品空白样，按照“2.2.2样品前处理”处理样品，上机分析，考察是否存在干扰，见典型谱图1。
样品制备：称取1.00克的样品，按照“2.2.2样品前处理”处理样品，上机分析，考察是否存在干扰及分离度，见典型谱图2及详见下表7。
从空白样品谱图及实际样品谱图分析，空白样品在酸枣仁皂苷A处无干扰，实际样品酸枣仁皂苷A的分离度达到2.2
本实验之所以采用程序进样，是因为样品用1ml甲醇复溶后，直接甲醇进样时，可能是由于进样溶剂强度远大于流动相起始强度，导致峰型变差，精密度变差。而直接采用50%甲醇水复溶时，由于极性较大，杂质过多，专属性变差。因此采用进样程序，进样环内加入1体积水来混合，解决了上述问题，且重现性和精密度良好。
表1 酸枣仁皂苷A线性试验结果
表2 酸枣仁皂苷A重复性
表3 酸枣仁皂苷A回收率试验结果
表4 酸枣仁皂苷A检测限与定量限结果
谱图1
谱图2
通过对方法适用性、线性、精密度、准确度、检出限、定量限和专属性考察。采用HPLC-ELSD方法，对枣仁合剂提取物混合片剂中酸枣仁皂苷A的含量进行测定，操作简单，准确性高、重复性好，适合于酸枣仁合剂提取物混合片剂中酸枣仁皂苷A的含量的测定，也可尝试酸枣仁皂苷A的其他混合提取物的测试。
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