曹祖懋,赵亚莉,叶 青,胡 煜,李志刚△,时素华,姚海江
(1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 102488；
2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；
3.中国康复研究中心北京博爱医院，北京 100068)
脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)一般是指受到外伤作用而导致的损伤节段平面以下功能和感觉功能丧失的一种中枢神经系统疾病，严重影响患者的身心健康。研究表明在成人中枢神经系统中，轴突在受伤后再生十分困难且受到严格的条件限制，这种缺乏再生的能力可归因于成年后减弱了内在生长程序的激活以及缺乏生长允许分子，并含有许多生长抑制分子的局部环[1]。NGF、NT-3是经典神经营养因子家族中的成员，在促进SCI后的功能恢复中发挥了重要的作用[2]。目前的研究结果表明电针和重复性经颅磁刺激都对SCI大鼠的功能恢复起到促进作用：电针可通过抑制SCI后的炎症反应、细胞凋亡与促进神经再生等方式来影响神经功能的恢复[3-5]。而重复性经颅磁刺激(rTMS)在SCI后可促进皮质脊髓束的神经可塑性[6]，作为一种潜在的新的非侵入性治疗方法慢慢在SCI康复中崭露头角。本课题组前期研究已经证实“通督”电针可促进SCI大鼠受损脊髓节段的神经营养因子的表达[7]。然而关于电针联合rTMS治疗SCI效果的研究相对较少，故本研究运用电针联合rTMS干预SCI大鼠，意在观察大鼠神经功能评分及其损伤部位神经营养因子NGF、NT-3的表达，评价电针联合rTMS对SCI的治疗效果，为临床运用电针联合rTMS治疗SCI提供实验数据支持。
1.1 实验动物及分组
Sprague-Dawley(SD)大鼠120只，体质量为180～220 g，由北京维通利华公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2016-0006，饲养于北京中医药大学动物房，给予自然照明和自由摄食、饮水，室温(25±2)℃,湿度45%～55%。适应性喂养3 d后进入实验。随机分为空白组、假手术组、模型组、电针组、rTMS组与联合组(电针+rTMS)，其中模型组、电针组、rTMS组与联合组再随机分为1 d组与7 d组，各12只。
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1 试剂 rabbit anti-NGF(美国Abcam公司ab52918);rabbit anti-NT-3(美国Abcam 公司ab16640);碘伏消毒剂(北京联昌卫生消毒用品有限公司);75% 消毒酒精(邯郸市捷利康商贸有限公司);4% 组织细胞固定液(北京酷来搏科技有限公司);兔二步法检测试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);Western Blotting检测试剂盒(中国江苏凯基生物技术股份有限公司);尼氏染色液、苏木素伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。
1.2.2 仪器 Allen’s打击装置(北京协和医学院微循环研究所);电推剪(深圳市科德士电器有限公司);韩氏电疗仪(北京华卫产业开发公司);华佗牌针灸针(0.3 mm×25 mm,苏州医疗用品厂有限公司);经颅磁刺激仪(武汉依瑞德医疗设备新技术有限公司);电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);RM2235 组织切片机(德国LEICA公司);BX53自动化智能型正置研究级显微镜(日本OLYMPUS公司);移液器(德国eppendorf);电泳仪(美国Bio-rad Power Supplies Basic);台式恒温振荡器(中国上海精宏实验设备有限公司 THZ-312)多功能酶标仪(美国MD Spectramac M3)、PH计(美国OHAUS STARTER 2C);分析天平(中国精密分析天平 JA3003)。
1.3 造模方法
术前8 h禁食禁水，手术器械消毒1 h，大鼠称重后以10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，放置于自制弓形手术台上，剃去后背毛发后消毒，以T10棘突呈中立位为标志，向上依次定位T9～11，用手术刀分离后背肌肉，暴露T9～11段棘突和椎板；
眼科弯剪剪除T10椎板及其上关节突和下关节突，暴露脊髓；
采用自制的改良式Allen’s打击装置，致伤量为10 g×5 cm，造成T10～11节段脊髓损伤，快速缝合伤口，瓦灯照射大鼠直至清醒，术后单笼饲养，保持垫料干燥，定时膀胱挤压帮助排尿。造模后待老鼠清醒给予5 μ单位青霉素钠，防止感染，假手术对照组只暴露脊髓，不损伤，然后缝合伤口。评价模型是否成功的依据为：①身体痉挛性颤动；
②尾巴痉挛性摆动；
③硬脊膜内充血或血肿，麻醉醒后双下肢表现为不完全瘫痪。
1.4 干预方法
1.4.1 “通督”电针组 参照全国针灸学会实验针灸研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱” 选取相当于人体解剖部位的“大椎”“命门”。用华佗牌规格0.25 mm×15 mm毫针进行针刺，进针约0.6 cm。针柄连接韩氏电疗仪，上接阴极，下接阳极，持续脉冲电流，频率2 Hz，强度2 mA， 治疗时间20 min， 输出强度在刚开始时以背部肌肉出现轻微抽动为度，待其适应后则以双下肢瘫痪肌肉出现有节律的收缩为度。1 d于造模清醒后2 h治疗1次，以后同一时间每天重复治疗1次，持续到达预定时间。
1.4.2 rTMS组 采用YRD CCY-I型磁刺激仪(武汉依瑞德医疗设备新技术有限公司)，脉冲磁场峰值强度为 3 T。造模 1 d 后，将清醒状态下的大鼠置于固定器中，头部固定，圆形线圈(直径70 mm)磁场中心置于大鼠左前囟上方，强度为最大强度(3 T)的21%。刺激频率 5 Hz。每序列2 s，间歇28 s，共15 min。1 d于造模清醒后2 h治疗1次，以后与1 d同一时间每天重复治疗1次，持续到达预定时间。
1.4.3 联合组 干预方法同电针组和rTMS组。
1.4.4 空白组 相同饲养条件下不做任何处理。
1.4.5 模型组及假手术组 造模后也不做任何处理，但均要在督脉电针、经颅磁刺激治疗时抓取1次，以保证处理条件相同。
1.5 行为学评价
大鼠BBB运动功能评分[8]：分别于大鼠造模后1 d、3 d与7 d同一时间由2位熟悉评分标准且不知道分组的研究人员进行分数评定，用以评定大鼠后肢各关节活动、步态及协调功能和运动中爪的精细动作。最后取其平均值作为其最终得分。
1.6 HE染色和尼氏染色
分别在术后1 d、7 d治疗相应天数后取各组大鼠6只，以10%水合氯醛(3.5 mL/kg) 腹腔注射麻醉，打开胸腔，充分暴露心脏。用灌注针从心尖部插入直至主动脉，剪开右心耳，灌注生理盐水；
待肝脏颜色呈灰白色且从心脏流出的液体由红色变成透明清亮的液体时，灌注4%多聚甲醛溶液，待大鼠出现四肢抽搐及全身僵硬、肝脏变硬可停止灌注。以脊髓打击点为中心，剥离肌肉取出T9～11脊髓节段，浸入到4%多聚甲醛溶液中固定。将固定好的组织进行常规脱水、石蜡包埋和切片。分别进行HE染色和尼氏染色。
1.7 Western Blot
分别在术后1 d、7 d用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，迅速剪下大鼠损伤节段脊髓，剥离肌肉与脊柱，将脊髓组织研磨后提取组织蛋白，用BCA法测量蛋白浓度，每组取相同质量的蛋白变性上样，SDS-PAGE凝胶电泳至目的条带进入凝胶最佳分离区(大约凝胶的2/3)，转至NC膜，将NC膜放入平皿中，加入含5%脱脂奶粉的封闭液，摇床振荡2 h；
一抗[NGF(1∶1 000)、NT-3(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)]的平皿中，4 ℃摇床振荡孵育过夜，TBST洗膜后加入二抗(1∶1 000)室温反应2 h，随后用ECL显影液显影，使用ChemiDoc MP Imaging System成像，最后使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。
1.8 统计学处理
2.1 BBB评分
术后1 d，模型组及各干预组BBB评分显著下降，模型组与各干预组相比,差异无统计学意义(P>0.05);术后3 d，各干预组较模型组评分上升，但均差异无统计学意义，且各干预组间差异也无统计学意义(P>0.05);术后7 d，rTMS、电针、联合组与模型组相比，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，rTMS组与电针组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，rTMS与联合组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，电针组与联合组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 各组大鼠术后不同时间段BBB评分比较
2.2 HE染色
空白组和假手术组形态规整，轮廓清晰，中间的灰质呈蝴蝶状。损伤后1 d，模型组可见脊髓组织结构被破坏，灰、白质界限模糊，灰质内观察到大量血细胞的浸润，出血严重，且有空泡形成，灰质区域的运动神经元大量死亡，神经元数目较空白组和假手术组明显减少，各治疗组与模型组病理改变相似,但出血现象相对减少。损伤后7 d，模型组可见血细胞聚集减少，白质与灰质的边界仍然模糊不清，灰质部位神经元数量极少，大量小胶质细胞增生，各干预组出血较模型组减少，神经元开始出现清晰的边缘，且神经元数量也比模型组多，出现小胶质细胞的增生，但较模型组相对要少。见图1。
图1 各组大鼠不同时间点受损脊髓(HE染色,bar=50 μm)
2.3 尼氏染色
空白组和假手术组灰质区域中的运动神经元胞浆中有呈蓝紫色的斑块状或条索状颗粒的尼氏体，造模后1 d模型组及各干预组神经元数量减少，且部分神经元尼氏体结构模糊，树突和轴突较少。造模7 d后，模型组和rTMS组有少量尼氏体重现，电针组和联合组重现尼氏体数量较模型组和rTMS组多。见图2。
图2 各组大鼠不同时间点受损脊髓(尼氏染色,bar=50 μm)
2.4 NGF的表达
术后1 d，模型组及各干预组NGF含量显著下降，模型组与各干预组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后7 d，rTMS组、电针组、联合组与模型组比较NGF含量增加，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，电针组与rTMS组比较NGF含量增加，差异有统计学意义(P<0.01)，联合组与rTMS组相比NGF含量增加，差异有统计学意义(P<0.01)，联合组与电针组比较NGF含量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表2。
注:1.空白组；
2.假手术组；
3. 1 d模型组；
4. 1 d rTMS组;5.1 d电针组;6. 1 d联合组；
7. 7 d模型组；
8. 7 d rTMS组;9.7 d 电针组；
10. 7 d联合组。图3 各组大鼠受损脊髓组织NGF、NT-3蛋白的表达情况
表2 各组大鼠术后不同时间段NGF的表达
2.5 NT-3的表达
术后1 d，模型组及各干预组NT-3含量显著下降，模型组与各干预组比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后7 d，rTMS组与模型组比较NT-3含量增加，差异无统计学意义(P>0.05)，电针组、联合组与模型组比较NT-3含量增加，差异均有统计学意义(P<0.01)，电针组与rTMS组比较NT-3含量增加，差异无统计学意义(P>0.05)，联合组与rTMS组比较NT-3含量增加，差异有统计学意义(P<0.01)，联合组与电针组比较NT-3含量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表3。
表3 各组大鼠术后不同时间段NT-3的表达
《难经》云：“督脉者，……起于下级之俞，并入脊里，上至风府，入属于脑”，由此可见督脉与现代脊髓的解剖位置高度重合，因此督脉和脊髓有着密切的联系，同时《黄帝内经》中还记载：“身有所伤，血出多及中风寒，若有所坠堕，四肢懈惰不收，名曰体惰”以及“督脉为病，脊强反折……治在骨上”。描述了中医对SCI的认识，并且明确了治疗应当从督脉着手。SCI的本质为督脉受损，而督脉统督一身阳气，为阳脉之海，督脉受损则连及手足三阳经，从而导致四肢活动不能与二便失禁[9]。“大椎”为手足三阳经与督脉的交会穴，有统摄一身阳气的功用，针刺可通督行气，而“命门”位于两肾之间，为元气之根本，生命之门户，针刺可益气壮阳。
在中枢神经系统的再生和发育过程中，轴突再生和突触连接对于SCI后实现最佳功能恢复至关重要[10]。在过去的几十年中，许多的治疗策略，包括针刺治疗旨在改善损伤脊髓神经保护和神经再生能力[11-13]，SCI后的各种继发性损伤致使孕育不利于神经再生的微环境。导致SCI后不能成功修复的原因可归结于[14-16]:①受损神经元生长能力弱；
②由于过度炎症激活和髓鞘碎片积聚导致再生微环境恶化；
③胶质瘢痕、囊腔和抑制分子的形成。因此，如何改善受损神经元的内在能力以及如何为轴突再生创造最佳微环境是恢复SCI的关键问题。神经营养因子(NFT)是再生轴突微环境中的一组关键因素，除了可以滋养中枢神经系统外，还参与损伤后中枢神经系统的修复[17-18]。
NGF是第一个被发现的神经营养因子，其特异性受体为TrkA，在发育过程中，神经系统突触后细胞负责大部分NGF释放，从而引导适当的靶神经支配。NGF与TrkA在交感和感觉轴突终末结合，然后复合物NGF/TkA逆行运输到神经元细胞体，在那里激活神经元存活和分化的分子途径，有研究表明：NGF能提高细胞生长速度和分化且促进神经突的发育，可积极增强AD患者的记忆和学习能力[19-20]，NGF也能够直接与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)相互作用，调节轴突生长和存活，这种新机制可能介导生长轴突和髓鞘形成之间的通讯[21]，从而促进运动功能的恢复。NT-3是基于NGF和脑源性神经营养因子同源性而发现的，有充分证据表明，NT-3不仅在神经元的发育和分化中发挥重要作用，而且在受损神经元的存活和轴突再生中也发挥着重要作用。NT-3已显示影响微管相关蛋白2(MAP2)的基因表达，该蛋白被认为与神经系统生长过程中的活跃轴突生长有关[22-24]；
此外，还有研究证明了将NT-3局部注射到固定的皮质脊髓束(CST)靶区能够促进CST侧索发育，这对于靶区发现、神经支配和突触形成是必要的。更重要的是NGF和NT-3可通过抑制SCI后一氧化氮(NO)过多释放所致的神经毒性作用和抑制Bax表达，促进Bcl-2表达，对SCI后神经元凋亡起抑制作用，从正反两个方面促进SCI后的恢复[25]。
TMS的基本原理为通过线圈引导几个特斯拉的磁场，随着磁场的快速变化，会产生感应电流。虽然TMS诱导的磁场力在通过脑外组织(头皮、骨骼与脑膜)会降低，但它仍然能够诱导足以使浅表轴突去极化并激活皮质中的网络的电流[26]，从而调节一系列生理生化反应，双向调节神经功能的长时程增强或长时程抑制，从多水平发挥神经可塑性调节。而rTMS则是在此基础上的特定大脑区域给予重复的磁刺激，rTMS可以激活不同水平的神经元，不仅产生生物学效应，而且影响局部和功能相关的远侧皮层功能，实现皮层功能的区域重建。来自大脑的更多神经冲动沿着脊髓传递到运动神经元，因此可以最大限度地利用残留的神经纤维连接；
这不仅有助于SCI后的神经再生，还可以增强大脑的可塑性[27]。研究表明：若想要起到增强大脑皮质的兴奋性作用，则刺激强度应≥5 Hz，而当刺激强度≤1 Hz时，则会降低大脑皮质的兴奋性[28]。研究表明：rTMS在治疗SCI后痉挛、神经性疼痛以及促进运动功能恢复方面展现出了良好的疗效[6,29-30]。其可能的机制是rTMS通过刺激患者的大脑皮质，产生兴奋效应，促使残余的下行皮质脊髓通路的开放，改变细胞兴奋性，加速神经细胞再生、诱导轴突侧芽生长、促进神经重塑进而促进脊髓功能的恢复[31]。
现代研究表明电针可以通过提高机体清除自由基的能力，排除微环境中不利于脊髓恢复的因素，降低了细胞受自由基攻击的严重程度，从而减少脊髓的继发性损害，为脊髓的恢复提供了前提条件，电针可以减少细胞凋亡、引导再生的轴突穿过脊髓损伤区并沿着正确的路径生长、促进神经功能的恢复促进神经元再生并建立新的突触联系。故以电针刺激督脉治疗SCI，有着较为理想的疗效[3-5]。前面已经阐述中医认为SCI与督脉关系密切，而“督脉入络脑”，表明SCI与大脑也有紧密的联系，现在也有研究表明因为脊髓结构完整性以及脊髓与大脑间双向通信流中断，SCI可导致脑结构和功能的重塑[32]。电针和经颅磁刺激分别从脊髓和大脑两个方向治疗SCI，且都取得了良好的效果，然而关于二者联合应用的研究还相对较少，故本研究从神经营养因子促进SCI后神经再生的角度切入观察、分析SCI大鼠受损脊髓节段NGF、NT-3的表达情况。从促进神经再生的角度去探讨电针联合经颅磁刺激对脊髓损伤后的神经可塑性的影响，为“通督”电针联合rTMS干预的临床应用提供实验依据。
本研究结果中，术后7 d rTMS组与模型组相比NT-3含量虽然增加，但差异无统计学意义，其可能的原因是对于NT-3蛋白来说，7 d的rTMS治疗时间较短，未能产生积累效应，然而联合组NT-3蛋白含量最高，则可能是rTMS与电针联合后产生了协同效应，值得注意的是，神经元的去极化可导致神经元膜上L型电压门控Ca2+通道(L-VGCC)的开放和钙内流的增加。此外，神经元去极化诱导的钙流入可刺激钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMKs)通路，并激活神经元合成和分泌NT-3等神经营养因子[33-36]。电针可诱导神经元去极化，同时rTMS的作用机制也与神经元的去极化有关。这可能是协同效应的机制之一，而选择1 d和7 d这两个时间点的原因则是：一方面可以看损伤后的即刻反应，表明SCI后大量神经元等细胞坏死，二来是更好地表现各干预的疗效，与模型组更好地进行比较，反映出一个动态变化的过程。
本研究从电针联合rTMS促进SCI后大鼠脊髓组织细胞中神经营养素NGF和NT-3蛋白的角度，明确了二者都能促进损伤大鼠的功能恢复，且二者联合的效果更好，其具体的机制可进一步研究探讨，以期为电针联合rTMS治疗SCI的应用提供更加明确的依据。
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