叶莉莎，张 挺，廖 聪，李婷婷，田振东，胡 敏*
(1.华中农业大学 动物医学院 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070；
2.华中农业大学 农业农村部马铃薯生物学与生物技术重点实验室，湖北 武汉 430070)
捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)是严重威胁反刍动物健康的消化道寄生线虫之一[1-4]。目前，捻转血矛线虫的防制主要依赖药物治疗，但耐药现象频发，因此对捻转血矛线虫疫苗的研发刻不容缓[5-7]。捻转血矛线虫氨基肽酶H11是目前从捻转血矛线虫体内分离到的最好的疫苗候选抗原之一，存在大量的抗原表位[8-9]。而体壁蛋白Hc23也能刺激宿主产生明显的保护作用[10]。已有研究表明，应用大肠杆菌[11-14]、秀丽隐杆线虫[15-16]和昆虫细胞[17]等多种表达系统表达捻转血矛线虫抗原分子的效果不佳，无法达到预期的免疫保护作用，甚至没有免疫效果。
目前，植物表达寄生虫抗原的研究报道日益增多[18-22]。植物细胞表达系统在表达外源蛋白的折叠和组装上跟动物更为相似，从而具有与动物细胞表达产物相似的生物活性和免疫原性；
其糖基化作用也是在高尔基体和内质网等细胞器上进行复杂的糖基化修饰以及额外的果糖、木糖等残基修饰，从而避免了糖基化修饰缺失而造成的生物学活性降低[23-24]。植物瞬时表达是利用改造的植物病毒载体，将外源基因整合到病毒载体后侵染植物，外源基因在病毒载体启动子的调控下进行转录表达[25]。应用植物表达系统表达捻转血矛线虫抗原可以为其疫苗的研发提供新的思路。
1.1 虫株、菌株及主要试剂捻转血矛线虫Hacon-5虫株来自墨尔本大学Robin B.Gasser实验室；
大肠杆菌菌株DH5α等由本实验室保存，pH7lic-EGFP质粒载体、根癌农杆菌菌株(GV3101)由华中农业大学园林学院田振东教授实验室赠送；
转染试剂Lipofectin 2000 Reagent购自美国Invitrogen公司；
反转录试剂盒、限制性内切酶、ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；
PCR产物纯化试剂盒购自Axygen公司；
DEPC原液、平衡盐溶液Earle’s Balanced Salt Solution(10×)购自美国Sigma公司；
青霉素链霉素两性霉素混合液Antibiotic-Antimycotic(100×)购自美国Gibco公司。
本氏烟草(N.benthamiana)种子由华中农业大学园林学院田振东教授实验室赠送。本氏烟草种植于恒温生长室内，种子播种于育苗盘中，90%湿度催芽，出苗后2周进行移栽，待缓苗后进行施肥和灌水等日常管理。幼苗在25℃、16 h光照、8 h黑暗的条件下生长4～5周。
1.2 构建表达载体pH7dNLSAP10op并转入农杆菌GV3101对捻转血矛线虫氨基肽酶基因Hc-ap-10进行生物信息学分析，将其基因序列(KU710359.1)、氨基酸序列(AML39764.1)及pH7lic-EGFP载体提交擎科生物，针对烟草偏爱密码子序列进行密码子优化后得到pH7-EGFP-AP10op。设计带有pH7lic-EGFP载体同源臂和两端添加核定位信号NLS的引物NLS-EGFP-NLS-F和NLS-EGFP-NLS-R(表1)，进行NLS-EGFP-AP10op-NLS片段的扩增，对载体片段和NLS-EGFP-AP10op-NLS进行同源重组，得到pH7dNLSAP10op质粒，通过电转法转入农杆菌GV3101。
1.3 构建表达载体pH7dNLSHc23并转入根癌农杆菌GV3101提取捻转血矛线虫成虫RNA并合成cDNA，根据Hc23的序列(CDJ92660.1)设计引物Hc23-F和Hc23-R(表1)，PCR扩增后对产物进行纯化，将回收得到的DNA片段Hc23与pTOPO-Blunt Simple载体进行连接后转入DH5α，挑取阳性克隆，-80℃保存。
设计带有EGFP同源臂和核定位信号NLS的引物NLS-EGFP-NLS-F和EGFP-R(表1)，进行NLS-EGFP片段的扩增。然后设计引物NLS-Hc23-F和NLS-EGFP-NLS-R(表1)对Hc23序列的膜外区进行扩增，得到Hc23-NLS片段。最后将载体片段、NLS-EGFP片段和Hc23-NLS片段进行同源重组得到pH7dNLSHc23质粒，通过电转法转入根癌农杆菌GV3101。
1.4 本氏烟草的瞬时表达将pH7dNLSAP10op和pH7dNLSHc23根癌农杆菌在LB平板培养基(Spe+和Rif+)上活化，28℃静置培养2 d。刮取划线菌接入10 mL LB液体培养基(含Kan+和Rif+)，28℃、200 r/min培养过夜，培养至D600 nm约为1.0，4 000 r/min离心10 min，收集根癌农杆菌沉淀。配置一定量含有2×10-4mol/L乙酰丁香酮，0.01 mol/L MgCl2，pH 5.6的0.01 mol/L MES溶液，洗菌体并重悬。2 d后测D600 nm值，调整pH7dN-LSAP10op和pH7dNLSHc23农杆菌悬浮液的D600 nm约为1.5。室温静置3 h，用1 mL无针头注射器以点注射方式(直径1 cm左右)在植物叶片上注射，24 h后荧光显微镜下观察叶片绿色荧光。
1.5 烟草叶片蛋白的提取和Western blot验证采用液氮磨样，取约0.1 g样品粉末加入800 μL蛋白裂解液(0.05 mol/L Tris,pH7.4,0.15 mol/L NaCl,1 mL/L Triton X-100,1 g/L sodium deoxycholate,0.1 g/L SDS)，同时现用现加10 μL蛋白酶抑制混合剂，充分混匀，10 000×g/min，4℃离心5 min。用12.5%的分离胶进行SDS-PAGE后，采用三明治式90 V转膜1.5 h；
5%的脱脂奶粉封闭4℃过夜；
TBST洗涤5次，5 min/次；
用His抗体(1∶3 000)室温孵育30 min后，TBST洗涤5次；
用鼠源二抗(1∶3 000)室温孵育30 min后，TBST洗涤5次；
采用化学发光显色法进行检测，通过Bio-rad自动曝光成像系统检测。
2.1 pH7dNLSAP10op表达载体的构建捻转血矛线虫氨基肽酶基因Hc-ap-10经生物信息学分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/)，结果显示Hc-ap-10无信号肽和跨膜区。考虑到目的基因的序列较长，蛋白相对分子质量较大，可能不利于捻转血矛线虫抗原在烟草叶片中表达，所以将Hc-ap-10基因进行了针对烟草偏爱密码子的基因优化，即AP10op，并与pH7lic-EGFP载体连接得到pH7-EGFP-AP10op。在表达目的基因的两端添加核定位信号NLS，扩增NLS-EGFP-AP10op-NLS目的片段，预期大小为3 695 bp，电泳条带与预期符合(图1)，最后成功构建了表达载体pH7dNLSAP10op，试图将外源表达的膜蛋白表达在烟草叶片的细胞核上。
M.DNA Marker；
1～3.NLS-EGFP-AP10op-NLS
2.2 pH7dNLSHc23表达载体的构建经生物信息学分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/)，表明Hc23基因编码的蛋白质全长序列中1～25 aa为信号肽跨膜区，因此决定对Hc23的膜外区进行扩增。分别设计引物对NLS-EGFP片段和Hc23-NLS片段进行扩增，NLS-EGFP片段为788 bp，Hc23-NLS片段为540 bp，凝胶电泳结果显示条带符合预期(图2)。最后连接载体片段，成功构建了表达载体pH7dNLSHc23。
M.DNA Marker；
1,2.NLS-EGFP；
3,4.Hc23-NLS
2.3 根癌农杆菌介导的pH7dNLSAP10op表达及Western blot检测将pH7dNLSAP10op在侵染烟草叶片24 h后，通过荧光显微镜观察蛋白表达情况，结果显示进行密码子优化并添加了核定位信号的AP10op蛋白能够在烟草叶片的细胞核中成功表达(图3A,B)，证明核定位信号的确能发挥将外源膜蛋白表达在植物细胞核的作用。称取一定量的烟草叶片在液氮中研磨成粉末状并用提取缓冲液处理后进行Western blot检测，发现可以成功检测到AP10op蛋白的条带(图3C)。
A.pH7dNLSAP10op的表达(×1 000)；
B.pH7dNLSAP10op的表达(×400)；
C.Western blot检测pH7dNLSAP10op的表达
2.4 根癌农杆菌介导的pH7dNLSHc23表达及Western blot检测pH7dNLSHc23构建成功后侵染本氏烟草叶片，24 h后采集叶片，于荧光显微镜下观察蛋白表达情况，发现Hc23表达量较高且主要表达在植物的细胞核内(图4A,B)。Hc23虽然没有经过密码子优化，但在本氏烟草细胞核中的表达量达到了与AP10op相当的水平。将pH7dNLSHc23侵染24 h 后的烟草叶片处理后进行Western blot验证，成功检测到Hc23的目的条带，证明Hc23蛋白成功表达在烟草叶片细胞中(图4C)。
A.pH7dNLSHc23的表达(×1 000)；
B.pH7dNLSHc23的表达(×400)；
C.Western blot检测pH7dNLSHc23的表达
本试验利用植物瞬时表达系统成功表达了捻转血矛线虫保护性抗原，相比于稳定转化系统需要几个月才能获得第一代转化植株，瞬时表达可以通过向植物细胞传递比稳定转化整合到宿主基因组中的T-DNA拷贝数量要多得多的T-DNA拷贝数，来实现受感染组织的高水平表达[26]。因此，植物表达系统的瞬时表达具有简单、快速、周期短、效率高等特点[27]，被广泛用于外源基因的表达[28]，为稳定转化提供了一种方便的替代方法。本氏烟草是最广泛用于瞬时转基因表达的宿主，不仅可以作为一种研究工具[29-31]，而且还作为大规模生产商业药用蛋白质的表达平台[32]。
寄生虫抗原基因在植物中进行表达时，密码子的优化对蛋白的表达量一般都能起到积极作用。有研究发现用烟草表达疟原虫裂殖子表面蛋白时，进行密码子优化后蛋白的表达水平提高了6倍[33]；
利用本氏烟草表达同种蛋白，其表达水平较原始基因序列提高40倍[34]；
在研究绦虫疫苗的报道中，密码子优化也是其重组蛋白表达的重要条件之一[35-37]；
同时关于蛔虫[38]、有钩绦虫[39]、刚地弓形虫[40]及疟原虫抗原[41-47]等在植物中表达的报道中，密码子优化都是提高重组蛋白表达量的重要条件之一。
构建密码子优化的pH7AP10op侵染烟草叶片之后，荧光检测结果表明目的蛋白表达在烟草细胞的细胞膜上(结果未显示)。而目前对于植物细胞细胞膜蛋白的纯化有一定难度，而植物细胞细胞核蛋白的纯化相对容易，所以在表达蛋白时需要将其引导到植物细胞的细胞核处进行表达。我们选择在目的蛋白的N、C两端添加核定位信号NLS，成功将目的蛋白pH7dNLSAP10op表达在烟草叶片细胞的细胞核上。
本试验中，构建捻转血矛线虫体壁细胞蛋白Hc23的pH7dNLSHc23表达载体，Hc23基因虽然未经密码子优化，但是其表达水平却相对较高，分析认为可能是由于Hc23蛋白相对分子质量较小，在烟草细胞中表达时受到的限制较AP10小，所以其表达水平相对较高。因此，我们推测密码子优化虽然有利于蛋白的高效表达，但是其可能对某些相对分子质量相对较小的蛋白不是必需的。
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