赵孟琪 综述，董 莉 审校
内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古呼和浩特 010050
帕金森病(PD)是一种黑质致密部多巴胺能神经元退行性变性、死亡，以残存神经元细胞质内α-突触核蛋白(α-syn)聚集形成路易小体为主要病理改变的运动障碍性疾病[1]。目前PD尚无有效的治疗方法，随着其发病率的逐年上升，社会负担也逐渐加重，成为当今社会面临的重大挑战之一。造成这种局面的原因是PD病因及发病机制不明。虽然研究表明PD特征性α-syn病理沉积物首先出现在肠神经系统(ENS)[2]，与肠道微生物群引起的肠道局部炎症有关，但其中具体的细胞及分子机制尚不清楚。肠神经胶质细胞(EGC)作为ENS数量最多的细胞，与肠道微生物群联系紧密。研究发现，鱼藤酮诱导的PD小鼠模型中存在肠道微生物群失调、肠道局部免疫性炎症、EGC病理性激活[3]。此外，来自PD患者的结肠活检标本显示,存在以胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达上调但磷酸化降低为特征的EGC[4]。这表明EGC病理性激活及其诱导的肠道局部免疫性炎症在PD中发挥着重要的作用。因此，本文对EGC的概述、EGC在PD患者肠道免疫性炎症中的作用及EGC对PD诊断和治疗的启示进行阐述。
1.1EGC的起源及异质性 EGC起源于神经嵴衍生细胞，在小鼠胚胎第9.0天至第13.5天，迷走神经嵴及骶嵴衍生细胞迁移、定植于发育中的肠道后分化为EGC及肠神经元，共同构成ENS；
而人类EGC在胚胎 8～11周时逐渐从肠壁肌间神经丛、黏膜下神经丛迁移至肠黏膜中，最后分布于所有类型神经元周围[5-6]。根据EGC在消化道中的位置和形态，可分为4种主要类型：Ⅰ型“原生质”EGC(位于神经节中)、Ⅱ型“纤维状”EGC(位于神经节结缔组织)、Ⅲ型“黏膜”EGC(位于黏膜下)、Ⅳ型“肌内”EGC(位于肌间)[7]。基于EGC在位置和形态上存在差异，BOESMANS等[8]研究发现大部分Ⅰ型EGC共同表达GFAP、S100钙结合蛋白B(S100B)和转录因子(Sox10)，Ⅱ型和Ⅲ型EGC只有少数会表达GFAP，而Ⅳ型EGC几乎不表达GFAP，表明其在表型上可能也存在不同。与此同时，BOESMANS等[8]进一步通过检测单个EGC在三磷酸腺苷(ATP)刺激下细胞内Ca2+浓度的变化作为EGC激活的替代标记探讨各种类型EGC的功能，结果显示，与Ⅱ型和Ⅲ型相比，Ⅰ型EGC具有更高的钙反应率，表明不同形态和定位的胶质亚群也表现出不同的活性。由此可以推测，EGC具有位置、形态、表型、功能上的异质性，这种异质性可能促使其在肠道中发挥多种功能。
1.2EGC的生理功能 EGC被认为是一种细胞网络，不仅为肠神经元提供结构支持和营养支持，还与肠道微生物群、肠上皮细胞、肠内分泌细胞、肠道免疫细胞相互作用，在ENS内建立稳态环境。其生理功能有：(1)EGC可表达多种模式识别受体(PRR)，例如Toll样受体(TLR)、炎症小体、晚期糖基化终产物受体(RAGE)等。TLR通过富含亮氨酸的细胞外结构域识别病原体相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式并形成受体复合物，引起Toll/白细胞介素(IL)-1受体结构域响应并募集下游衔接分子，促进细胞内信号转导并激活核因子-κB/p38蛋白激酶(NF-κB/p38MAPK)、Janus激酶/信号转导和转录激活因子等，导致炎症因子的表达、释放增加，EGC可表达TLR3、TLR4、TLR7[9]；
核苷酸结合域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体是先天免疫系统的重要组成部分，NLRP3可以识别不同的刺激而被激活，随之吸引凋亡相关微粒蛋白和富含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(caspase-1)组装成炎性体，触发caspase-1激活和caspase-1介导的IL-18和IL-1β的释放，从而引发细胞凋亡[10]；
RAGE是一种新的PRR，其可以结合胞外蛋白，例如S100B，引起细胞内促炎信号通路激活，最终导致促炎性细胞因子表达增加[11]。(2)生理情况下，EGC还表达释放GFAP、S100B、Sox8/9/10、蛋白脂蛋白1、43半通道蛋白(Cx43)等多种标志性蛋白及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、亚硝基谷胱甘肽等胶质衍生物质[6]，参与肠道多种病理生理过程。
2.1EGC响应微生物的侵袭而在PD中发挥作用 自从BRAAK等[12]发现PD的特征性α-syn病理沉积物分布在PD患者疾病进展各个阶段的黏膜下和肌间神经节之后，提出了一种假说：胃肠道的假定致病性损伤可能导致肠神经元内α-syn错误折叠，然后通过迷走神经传输到中枢神经系统(CNS)。虽然多项啮齿类动物研究通过将α-syn注入肠壁，发现α-syn可从胃肠道传输到大脑[13]，但却无法得出具体的致病因素。这种致病因素最有可能是肠道微生物，PD动物模型及临床试验也都发现肠道微生物的变化。而肠道微生物通过何种机制在PD的发生、发展中发挥作用仍处于正在探索的阶段。EGC特别是黏膜EGC因其位置特殊，可与肠道微生物群密切接触，并对微生物的侵袭作出反应。现发现，EGC在面对微生物的侵袭时表现为促炎及抗炎的两面性：其不仅可以响应病原微生物的侵袭而发生病理性激活，诱导肠道针对病原微生物的免疫炎性反应，目的是清除微生物；
还可以通过释放胶质衍生物而抑制肠道免疫性炎症，保护肠道屏障(IEB)，这可能是其在PD中发挥作用的基础，具体机制如下。
2.1.1EGC促进肠道免疫性炎症 (1)EGC可通过PRR识别PAMP而触发细胞内信号转导。相关研究发现细菌脂多糖(LPS)、IL-6可通过与EGC细胞膜上PRR的结合，激活EGC，触发TLR4/NF-κB等促炎信号通路及NLRP3炎性体的形成，促进肠道免疫性炎症以清除病原体[9,14]。有研究表明，PD患者体内产生LPS的革兰阴性菌增多，并且可以诱导肠道炎症，其是TLR4的一种主要配体[15]。最近，CHOI等[16]通过向小鼠直肠内注射奇异变形杆菌衍生的LPS，发现其可增加肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，并在治疗16 d后导致结肠中TLR4过度表达。这些效应扩展到大脑可引起黑质纹状体区域的小胶质细胞激活及中枢和肠道神经元中的α-Syn聚集。因此，过度的TLR4信号传导可能导致PD中肠道免疫性炎症而促进PD相关病理成分形成及疾病进展。紧接着GORECKI等[17]通过饮用水对小鼠模型长期、低剂量施用LPS，发现这会加剧α-syn过表达小鼠的PD病理学表现，进一步支持TLR4介导的肠道炎症在疾病进展中的作用。目前已经发现在PD小鼠模型中存在EGC病理性激活，并且TLR4表达增加和肠道炎症并存[18]，提示EGC上的TLR4信号通路可能积极参与PD的肠道炎症。(2)EGC可响应微生物的侵袭而表达和分泌促炎介质。研究者从暴露于细菌LPS的人肠肌间丛EGC的原代培养中发现，在LPS的刺激下，EGC上调了多种促炎介质的转录物，例如促炎性细胞因子(IL-6、IL-8、IL-33、TNF-α)、趋化因子(CCL2、CCL3、CCL12)、S100B[19]。促炎性细胞因子和趋化因子具有特殊的作用，因为它们可以进一步募集中性粒细胞、巨噬细胞及肥大细胞直接促进针对病原体的免疫性炎症。而S100B可通过多种方式促进肠道免疫炎症。有研究表明，肠道感染期间EGC释放S100B增加，S100B不仅可以与EGC表面的TLR4受体结合，通过激活下游NF-κB通路，促进黏膜一氧化氮(NO)的产生和释放[20]；
还可以通过自分泌的方式与EGC表面的RAGE受体结合，引起细胞内信号通路S100B/RAGE/PI3K/NF-κB激活，进一步促进促炎性细胞因子(TNF-α、IL-6)、趋化因子表达、释放增加及保护性因子IL-22表达、释放减少[11]，最终促进肠道免疫性炎症。对于EGC病理性激活后释放的炎症介质在PD中均发现表达升高，虽然细胞因子并非EGC特异性的，但不可否认其可能参与PD的肠道免疫性炎症。有研究发现，PD患者的血脑屏障(BBB)受损，外周细胞因子可以通过受损的BBB而进入CNS[21]，提示上述细胞因子可能通过受损的BBB进入脑内而参与PD的发生、发展，这还需要进一步研究证实。S100B是一种钙结合蛋白，在大脑中主要由星形胶质细胞表达、释放，有研究表明，S100B可以与小胶质细胞上的RAGE受体结合，引起小胶质细胞活化和迁移，随后小胶质细胞进一步释放释放CCL3、CCL5和CXCL12等趋化因子促进脑内神经炎症[22]。在PD动物模型中，S100B已被证明对神经退行性变有显著贡献，特别是1-甲基-4苯基-1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)诱导的PD小鼠模型中的多巴胺能神经元变性在S100B靶向消除后被部分抑制[23]。目前研究主要集中在星形胶质细胞释放的S100B在PD中的作用，鉴于越来越多的证据表明EGC在PD发病机制中起着至关重要的作用，对于EGC释放的S100B在PD中的作用有待进一步研究。(3)EGC可对细菌成分进行抗原提呈。EGC在接触细菌或寄生虫后，可表达主要组织相容性复合体-Ⅱ类分子而充当抗原提呈细胞，将LPS等呈递给CD4+T细胞，从而诱导CD4+T细胞活化并分化为辅助性T细胞(Th)17和调节性T细胞(Treg)[24]，引发针对病原体的免疫反应，并且最终引起促炎性细胞因子释放而促进肠道免疫性炎症。Th17是肠道黏膜免疫的主要适应性免疫细胞，而Treg是一种免疫抑制细胞，可抑制Th17功能，二者之间处于动态平衡，从而保证机体的免疫耐受[25]。大量研究表明，PD患者外周血存在Th17/Treg平衡失调，并且Th17和Treg均有机会进入CNS，PD尸检及动物模型研究也发现脑内Th17水平增加而Treg水平减少[25-26]。相关研究还发现Th17及其特征性IL-17对多巴胺能神经元的神经毒性作用，而Treg发挥神经保护作用[26]。因此，EGC与适应性免疫细胞之间的作用可能是其参与PD的一种机制。
2.1.2EGC抑制肠道免疫性炎症 除了促炎作用外，EGC还具有免疫抑制和抗炎作用。这些抗炎作用部分是通过释放胶质衍生物质来控制的。具体包括GDNF、BDNF等，这些胶质衍生物质可作用于自身及周围的免疫细胞而有益于减弱肠上皮通透性、抗炎作用和促进神经元存活。GDNF是肠道感染期间最有代表性的保护性因子，其可以通过与其他细胞上的酪氨酸激酶受体(RET)结合而减少促炎性细胞因子的产生并有助于维持肠上皮屏障功能。研究表明，GDNF释放后可与3型淋巴细胞(ILC3)上的RET结合，从而激活ILC3并促进抗炎因子IL-22的释放和肠道上皮细胞中修复基因的表达增加，保护结肠炎症上皮[27]；
释放的BDNF则通过下调EGC上的TLR4受体而降低LPS诱导的小鼠一氧化氮合酶及促症因子IL-6的表达[28]，减轻肠道炎症。现有证据表明，GDNF不仅能通过抑制肠道炎症而改善结肠炎上皮细胞功能，还能通过改善肠上皮细胞中的紧密连接而改善IEB功能及减轻由桥粒芯糖蛋白2损失引起的IEB功能损害[29-30]。CHEN等[31]的研究发现，便秘的PD患者血清GDNF水平较低，提出假设：低GDNF水平更容易导致肠黏膜屏障功能受损，肠道通透性改变，ENS更容易受到肠道菌群的影响，从而导致PD患者的便秘症状。由此，EGC源性GDNF可能在PD中发挥保护作用。综上所述，EGC既可以响应微生物的侵袭而被激活并释放促炎介质扩大肠道免疫性炎症，同时释放的促炎介质又可以进一步作用于EGC，形成类似于正反馈的闭环系统，级联放大肠道免疫性炎症；
相反，其释放保护性因子可以减轻肠道炎症而保护IEB功能，从而对抗微生物的侵袭。因此，EGC具有两面性效应，这可能源于其是一种异质性细胞群体。对于EGC病理性激活后启动的促炎信号通路及其释放的炎症介质均可能在PD的进展中发挥某些促进或者保护作用，除此之外其与适应性免疫细胞之间的相互作用可能促进CD4+T细胞向脑内聚集并与脑内先天性免疫细胞相互作用而促进PD的发生、发展。然而，对于EGC在PD中的确切作用还需要更多的临床前及基础实验来进一步探讨。
2.2EGC与PD中的α-syn聚集 研究表明，PD中存在EGC的病理性激活[32]。DEVOS等[33]通过在结肠活检中使用聚合酶链反应，发现与健康对照组相比，PD结肠活检中编码4种促炎性细胞因子和3种神经胶质标志物的mRNA转录物增加，表明PD中存在肠道炎症，并可能与EGC的病理性激活密切相关；
除此之外，PEREZ-PARDO等[18]的小鼠实验发现，口服鱼藤酮的小鼠结肠黏膜呈现促炎状态，存在结肠肌间神经丛EGC病理性激活、结肠α-syn聚集和多巴胺能神经元丢失，而免受鱼藤酮诱导的小鼠则表现为更少的肌间神经丛EGC激活、结肠α-syn聚集和多巴胺能细胞丢失，PEREZ-PARDO等[32]的最新研究通过对死亡小鼠结肠的固定切片进行免疫荧光染色，也发现EGC源性GFAP与α-syn的表达同步升高，推测EGC可能在肠道α-syn病理形成中也发挥着作用；
除此之外，有研究表明，α-syn可通过肠神经胶质Cx43半通道(通过Cx43半通道连接的神经胶质-神经胶质合胞体是胃肠道和中枢神经系统之间细胞间通信的途径)或迷走神经上升到中枢神经系统[34]，进一步发现EGC在α-syn上升到中枢神经系统的过程中也发挥作用。目前在CNS中发现细胞外α-syn可以刺激小胶质细胞和星形胶质细胞产生促炎分子和氧化应激效应物质，神经炎症和氧化应激可以促进并加剧神经退行性过程[35]，提示作为星形胶质细胞消化系统等效物的EGC也可能受到ENS中α-syn的刺激而激活从而加剧PD中肠道炎症。综上所述，PD中的EGC可能发生病理性激活，可能通过参与肠道免疫性炎症而促进ENS中α-syn错误折叠，并且有助于α-syn向大脑传播，反过来α-syn也可能作为一种效应分子进一步促进EGC病理性激活，未来应具体探索它们之间的复杂串扰。
3.1EGC对于PD诊断的启示 PD患者结肠组织中发现EGC反应性增生及其特异性的胶质标志物阳性，并且在PD早期就出现，因此通过胃肠黏膜活检获取EGC并进行分析可能优于α-syn对早期PD进行预测。传统的对于细胞类型的分析主要通过分选技术，如荧光活化细胞分选(FACS)，用于从特定细胞类型生成数据并更深入地了解这些细胞，然而这种方法需要大量的细胞制备或荧光报告信号，试验过程复杂，任何一个环节出现问题都会影响试验结果的准确性，从而使FACS复杂化，并且它对于组织中的EGC并不是很适用[36]。另一种可行的方法是通过单细胞RNA测序分析细胞特异性转录组，它能够提示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，目前已经应用于肿瘤学、神经科学等多个领域。近期SMAJI等[37]通过对6例特发性PD患者和5例年龄性别匹配的健康人死后中脑的41 000个单核转录组进行分析，可以区分出少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等多种细胞类型，并且发现这些细胞在PD中都存在明显的基因表达差异，最后得出小胶质细胞是与特发性PD风险基因相关的细胞类型。DROKHLYANSKY等[38]将单细胞测序用于人和小鼠ENS分析，发现肌间和黏膜EGC的表达基因存在明显不同，并且发现多个PD风险基因在ENS中富集，其中NRXN1、ANK2富集在EGC中，表明EGC的功能障碍可能会加剧CNS的疾病。以上结果说明了单细胞测序技术可达到对细胞类型的精准分析。EGC是一种异质性细胞群体，未来应利用单细胞测序技术的优势深入探索EGC的异质性在PD及其他胃肠道疾病中的作用。
3.2EGC对于PD治疗的启示 对于EGC相关信号通路、标志性蛋白的研究，可以发现潜在的治疗靶点，并可设计治疗策略来防止多巴胺能神经元进行性退化。主要作用靶点有：(1)靶向TLR4信号通路。减轻TLR信号传导可促进免疫平衡，迄今为止，已经发现了6种水平的负调控[39]。①TLR蛋白的降解；
②TLR及相关基因转录机制的下调；
③微小RNA的转录后抑制；
④释放作为可溶性诱饵的可溶性TLR；
⑤细胞内抑制剂；
⑥TLR与其配体结合后，TLR信号通路的膜结合阻滞剂。研究发现，敲除EGC上TLR4基因的小鼠可免受鱼藤酮诱导引起肠道炎症，这种小鼠表现为PD症状减轻[18]。(2)靶向S100B/RAGE/NF-κB信号通路。研究发现，喷他脒阻断S100B/RAGE/NF-κB通路可防止EGC激活、肠道炎症、神经元丢失[11]。(3)靶向GDNF。研究发现，5羟色胺受体激动剂可增加EGC源性GDNF，减轻肠道炎症并保护ENS中的神经元损伤[40]。虽然上述靶向治疗减弱了EGC激活、改善了肠道炎症，但EGC是一种功能异质性细胞，在PD中还未进行针对异质性EGC的精准治疗，未来可探索靶向异质性EGC实现疾病精准治疗的技术和方法。
随着PD肠道发病机制探索的不断深入，EGC在PD发生、发展中的作用日益显现，本文综述了EGC对微生物的侵袭作出反应的某些机制，希望可以对PD早期诊断及干预提供新的思路。EGC是一种异质性细胞群体，未来应利用单细胞测序技术的优势深入探索EGC的异质性在PD及其他胃肠道疾病中的作用，并进一步研发靶向异质性EGC实现疾病精准治疗的技术和方法。
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