李旭东，吴静澜，2，3▲，郭 兵，聂 倩，谢朝宇
(1贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025；
2国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；
3贵州中药炮制与制剂工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025)
随着社会发展，糖尿病已经成为人们健康的巨大隐患，不仅给患者自身带来极大的痛苦，也给家庭带来巨大负担。Ⅱ型糖尿病作为日常生活中常见的一种内分泌科代谢性疾病，其患者主要集中在中老年人中，其病因有遗传、环境、生活习惯等，主要表现为胰岛β细胞功能障碍及胰岛素抵抗，常伴随多种并发症[1-2]。目前对糖尿病的治疗主要为药物治疗，虽然能显著降低患者的血糖水平，但需要长期不间断用药，且效果并不是特别理想，给人们的生活带来了极大的苦恼。
高粱泡叶是蔷薇科植物高粱泡(RubuslambertianusSer)的干燥叶，其药味甘、苦，性平，具有清热凉血、解毒消疮等功效，可应用于治疗感冒发热、咳、皮肤糜烂、黄水疮等[3]。前期实验对高粱泡叶提取物借助UPLC-Q-Orbitrap-MS技术分析其化学成分，在此基础上，本研究通过结合网络药理学对高粱泡叶中成分及其相关靶点、信号通路进行分析，构建高粱泡叶“中药-成分-靶点”网络，最终获得治疗Ⅱ型糖尿病的相关化合物。为高粱泡叶在后期新药研发中提供新理论、开发高粱泡叶的新用途。
1.1 高粱泡叶活性成分的筛选及靶点预测
在课题组前期对高粱泡叶乙醇提取物化学成分进行液质联用分析的基础上，通过查阅中外关于高粱泡叶研究的相关文献，搜索高粱泡叶化学成分，通过 ETCM(http：//www.tcmip.cn/ETCM/)数据库对已经检索到的高粱泡叶化学成分进行筛选，筛选出Druglikeness Weight >0.49、Druglikeness Grading为中等(Moderate)或好(Good)的化合物。如果有的化合物不能在ETCM 数据库检索到，可通过TCMSP(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库查询OB(OB≥30%)和DL(DL≥0.18)信息进行高粱泡叶化学成分筛选[4-5]。通过SwissTarget Prediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)数据库和Similarity ensemble approach(SEA)(https：//sea.bkslab.org/)数据库检索高粱泡叶活性成分相关靶点。
1.2 Ⅱ型糖尿病相关靶点
通过OMIM(http：//https：//omim.org/)、genecard(http：//www.genecard.org/)数据库，以“type 2 diabetes mellitus ”关键检索词查找治疗Ⅱ型糖尿病的相关靶点。将高粱泡叶相关成分靶点和Ⅱ型糖尿病靶点导入Venny2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线平台分析取靶点交集，并绘制韦恩图。
1.3 构建“高粱泡叶-化合物-活性靶点”网络
根据得到的相关交集靶点及活性成分，通过表格建立“高粱泡叶-化合物-活性靶点”一一对应关系网，将表格导入Cytoscape 软件绘制“中药-化合物-活性靶点”网络图。
1.4 蛋白质相互作用图构建及靶点分析
借助STRING((https：//string-db.org/)分析平台，输入筛选出来的预测靶点，选择“Homosapiens”，分析完成后以“tsv”格式文件输出，将文件Cytoscape 3.7.2(http：//www.cytoscape.org/)软件中，安装“cytoHubba”插件对靶点的度值进行计算，得到核心预测靶点。
1.5 核心靶点的功能富集分析和通路富集分析
采用Metascape(http：//metascape.org/)数据库，对筛选得到的高粱泡叶治疗糖尿病靶点进行基因生物过程(GO)富集分析与信号通路(KEGG)富集分析，利用微生信在线平台进行可视化分析并作KEGG气泡图和GO气泡图及柱状图。设置P<0.01表示差异有统计学意义。
1.6 分子对接和靶点验证
选取“活性成分-靶点-通路”网络中度值排名靠前的靶点与相应活性成分进行分子对接验证。在PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)搜索并下载靶点的pdb格式文件，在PubChem数据库下载活性成分的sdf格式文件，并借助软件OpenBabel2.4.1转化为mol2格式文件。利用PyMOL软件去除蛋白结构的水分子及小分子配体，并导入AutoDock软件进行加氢等预处理。对受体和配体进行分子对接，分析其结合活性。并利用 PyMOL软件将分子对接验证结果进行可视化。
2.1 活性化合物的筛选及靶点预测结果
通过在“1.1”条件下对高粱泡叶化学成分的筛选，得到12个符合化合物，通过Swiss Target Prediction数据库和Similarity ensemble approach(SEA)数据库检索高粱泡叶活性成分相关靶点，共得到靶点169个。
表1 筛选得到的12个活性成分Tab.1 Twelve active ingredients screened out
2.2 高粱泡叶成分靶点与Ⅱ型糖尿病靶点交集
在“1.2”条件下检索得到的糖尿病靶点共2026(Relevance score≥20)个，通过Venny 2.1在线平台分析73交集靶点，韦恩图如图1所示。
图1 成分靶点与烫伤作用靶点Venn图Fig.1 Venn diagram of component targets and disease targets
2.3 中药-化合物-靶点相互作用网络构建
按“1.3.3”项下方法进行PPI网络构建，结果如图所示，图中共有73个节点，537条边，平均节点度值为14.7。将得到的PPI网络信息以TSV格式文件下载并保存图片格式，将数据文件导入Cytoscape 3.7.2软件中进行分析，选择“Degree”并进行值的计算，节点在网络中的重要性和Degree值相对应，因此得到的核心靶点网络图如图2所示。由图可知AKT1、EGFR、SRC、ESR1、ERBB2、MMP9、CCND1、MMP2等为关键靶点基因。
图2 靶点间相互作用网络和核心成分网络图Fig.2 Interaction network of targets and network of core components
2.4 高粱泡叶-成分-作用靶点网络构建
采用Cytoscape软件构建“中药-成分-活性靶点”网络，该网络有85个节点和126条边，外圈为高粱泡叶成分靶点和Ⅱ型糖尿病靶点的共同靶点(预测靶点)，中圈代表的是筛选得到的高粱泡叶活性成分，圆心即代表的是高粱泡药材(图3)。
图3 “药物-活性成分-靶点”网络Fig.3 Drug-active ingredients-targets network
2.5 核心靶点GO和KEGG富集分析
在“1.3”进行靶点通路富集分析共得到KEGG 富集结果23条，根据P 选取排名前10的结果绘制高级气泡图，高粱泡叶治疗Ⅱ型糖尿病主要涉及癌症的途径(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、化学致癌作用(Chemical carcinogenesis - receptor activation)、膀胱癌(Bladder cancer)、黏着小带(Adherens junction)、癌症中小分子核糖核酸(MicroRNAs in cancer)、5-羟色胺能突触(Serotonergic synapse)、卵巢类固醇生成(Ovarian steroidogenesis)等通路。GO富集分析主要包括细胞组分(CC)、分子功能(MF)和生物过程(BP)三个方面，通过GO富集分析，共得到MF富集结果22个、BP 富集结果62个、CC富集结果19个，选择富集前十名进行优化并作气泡图及柱状图，如图5所示，MF蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性(protein serine/threonine/tyrosine kinase activity)、芳香化酶活性(aromatase activity)、激酶结合(kinase binding)、胰岛素结合(insulin binding)等。BP主要包括跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路(transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway)、细胞对氮化合物的反应(cellular response to nitrogen compound)、对无机物的反应、(成纤维细胞增殖的正调控(positive regulation of fibroblast proliferation)、对UV-A的反应(response to UV-A)、细胞应激反应的调节(regulation of cellular response to stress)、腺体发育(gland development)等。CC主要包括受体复合物(receptor complex)、细胞顶端部分(apical part of cell)、膜侧(side of membrane)、蛋白激酶复合物(protein kinase complex)、细胞前缘(cell leading edge)、细胞质核周区(perinuclear region of cytoplasm)、细胞间连接(cell-cell junction)、膜的细胞质侧(cytoplasmic side of membrane)等。
图4 GO富集分析和KEGG富集分析气泡图(排名前10)Fig.4 Bubbles of GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis(top 10)
图5 GO富集分析柱状图和KEGG带色彩梯度条形图(排名10)Fig.5 Histogram of GO enrichment analysis and bar graph of KEGG band color gradient(top 10)
2.6 分子对接
根据靶点和相关成分的重要性，选择AKT1、SRC、EGFR三个核心靶点与Quercetin、Genistein、Ellagic acid三个相对应核心成分，根据化合物-靶点对应关系进行分子对接，结果见表2。
表2 分子对接结果Tab.2 Molecular docking results
本研究通过采用网络药理学的方法，探索高粱泡叶对治疗糖尿病可行性分析。通过在前期本课题对高粱泡叶采用液质联用对其提取物进行化学成分分析的基础上，结合国内外文献查阅高粱泡有叶的化学成分，通过数据库筛选得到12个符合化合物，通过SwissTargetPrediction数据库和Similarity ensemble approach(SEA)数据库检索高粱泡叶活性成分相关靶点，共得到靶点169个。通过OMIM、genecard数据库，以“type 2 diabetes mellitus ”关键词共检索得到2026符合条件的相关靶点。
通过Cytoscape 软件的“cytoHubba”插件对靶点度值进行计算，筛选得到AKT1、EGFR、SRC、ESR1、ERBB2、MMP9、CCND1、MMP2等核心靶点基因和鞣花酸、槲皮素、山奈酚、染料木素等核心活性成分。研究表明，可通过调节PI3K/AKT信号通路，保护大鼠免受糖尿病所致的肾脏损伤[6]，糖尿病患者的再生受损、焦虑情绪等表现与ErbB2受体的功能减弱有关[7]。鞣花酸通过纠正糖尿病小鼠胰岛素在脂肪组织中信号转导障碍和促进肝脏自噬流，从而达到改善糖尿病小鼠症状[8-9]，另外有研究，染料木素对糖尿病大鼠的骨膜反应具有很好的改善作用[10]。
GO富集分析表明，高粱泡通过蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、成纤维细胞增殖的正调控、胰岛素结合、血管内皮生长因子激活受体活性等多种生物学过程来抵抗糖尿病。
图6 分子对接结果Fig.6 Molecular docking results
KEGG富集分析结果表明：高粱泡叶治疗Ⅱ型糖尿病主要涉及癌症的途径(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、ErbB信号通路等。研究表明，通过调节PI3K/AKT通路可以减轻糖尿病肾病引起的炎症和氧化应激[11]。ErbB信号转导通路通过对TGF-β1的表达抑制，从而能间接达到抑制糖尿病心肌病大鼠心肌组织纤维化的作用[12]。这些结果可能为进一步研究高粱泡叶治疗Ⅱ型糖尿病提供相应理论基础，后期研究我们还将进行高粱泡叶治疗Ⅱ型糖尿病的验证实验，为高粱泡叶药效物质基础提供更有力的依据。
分子对接结果显示，核心靶点和相应化合物之间结合自由能≤-1.2 kcal/mol，对接效果良好，表明核心靶点与其相对应的高粱泡叶化学成分有较强的亲和关系，本研究中网络药理学的预测结果具有一定的合理性。
综上所述，网络分析结果表明，高粱泡叶具有治疗Ⅱ型糖尿病的可能性。为证明此结果，后期将会进行相关的实验验证。
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