黄鑫，朱璐，林梅青，王继蕊，商秀丽
（中国医科大学 1.附属第一医院放射科，沈阳 110001；
2.附属盛京医院康复中心，沈阳 110136；
3.附属第一医院神经内科，沈阳 110001）
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是慢性进展性中枢神经系统退行性疾病，其病理学标志包括β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）积聚、神经纤维缠结、神经元变性等［1］。神经血管功能障碍促进AD的发生发展。血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）是中枢神经系统的重要组成部分［2］。生理条件下，BBB能选择性地限制毒素从外周血液进入中枢神经系统，调节新陈代谢，维持大脑微环境的稳态［3-4］。内皮细胞间的紧密连接蛋白是维持BBB生理功能的重要结构基础。研究［5］显示，AD发病早期就出现了BBB通透性增加和血管损伤等功能障碍。
长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200 nt的非编码转录本，在多种生物学过程中发挥关键作用［6］。越来越多的研究［7］表明，lncRNA可对下游靶基因的染色质修饰、转录和转录后调控产生影响。研究［8］发现，lncRNA在许多神经系统疾病（癫痫、神经系统退行性疾病和遗传性疾病等）中表达失调。MEG8是小核仁宿主基因，定位于染色体14q32.3的基因簇中。MEG8通过吸附miR-181a-5p抑制氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移，并诱导细胞凋亡，参与对动脉粥样硬化进程的调控［9］。MEG8可通过与多梳抑制复合物2（EZH2）蛋白的增强子结合，诱导组蛋白H3甲基化并调节上皮-间质转化相关的细胞形态学变化［10］。目前，关于MEG8在AD微环境下BBB中调节作用的研究尚未见报道。
在体外AD微环境BBB的研究中，目前是以Aβ处理的人脑微血管内皮细胞模拟AD微环境下BBB来进行。本研究探讨MEG8对AD微环境下BBB通透性的作用，旨在为AD早期BBB的功能改变提供新的实验依据。
1.1 细胞培养
人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3由法国巴黎第五大学COURAUD教授惠赠，EBM-2培养基培养。人脑正常星形胶质细胞（normal human astrocyte，NHA）购自上海中科院细胞库，DMEM（含10%胎牛血清）培养。所有细胞均于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。每2～3 d细胞换液或者传代。Aβ（美国Sigma公司）溶解后加入细胞中共同孵育。
1.2 构建体外BBB模型并进行Aβ处理
NHA细胞接种于6孔Transwell小室（0.4微孔膜）的下室，加入3 mL的DMEM完全培养基进行培养，待细胞长至约80%后，将2×105个Aβ处理的人脑微血管内皮细胞（Aβ-incubated human brain microvascular endothelial cells，AD-ECs）接种于鼠尾胶原预处理的Transwell小室的上室。上下室内均加入适量的EBM-2完全培养液。48 h后换液，培养4 d后体外BBB模型建立。
1.3 稳定转染沉默MEG8质粒及分组
待细胞长至接近80%融合时，按照转染试剂Lipofectamine LTX说明书，应用Lipofectamine LTX试剂将MEG8沉默质粒及其阴性对照质粒转染至细胞中，48 h后显微镜下观察细胞带光情况。随后，应用G418筛选细胞，每隔24 h梯度（0.2 mg/mL）加药1次，最高至2 mg/mL筛选出稳定转染的AD-ECs。按照细胞处理方法分为：对照组、转染MEG8阴性对照组（sh-NC组）、转染MEG8沉默质粒组（sh-MEG8组）。
1.4 实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）检测
使用TRIzol提取细胞中的总RNA，测定RNA浓度。获取的RNA应用染料法一步法试剂盒来检测MEG8的表达情况。以GAPDH为内参，以2-ΔΔCt计算相对表达量。
1.5 跨内皮阻抗（transendothelial electric resistance，TEER）值测定
应用微孔电阻系统检测TEER值，在37 ℃恒温下检测各组TEER值的变化，每组样品读数减去空白Transwell小室的微孔膜背景电阻值，之后与Transwel小室表面积的乘积为最终TEER值（Ω·cm2）。
1.6 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）含量测定
应用转染细胞建立体外BBB模型后，将含有0.5 μmol/L HRP的无血清EBM-2培养基加入Transwell小室的上室中，收集下室的培养基并通过TMB显色法测量HRP含量（pmol/cm2）。
1.7 免疫荧光观察
选取生长状态良好的细胞培养在含1%明胶包被的盖玻片上，待细胞生长融合至95%～100%时，PBS清洗3次。4%多聚甲醛（ZO-1）室温固定30 min后0.3% Trixton-100室温通透10 min，或甲醇（occludin无需通透）-20℃ 固定10 min，PBS清洗3次。5%BSA室温封闭2 h，PBS清洗3次。加入1%BSA稀释的一抗（ZO-1和 occludin均1∶50稀释），4 ℃ 湿盒孵育过夜。复温45 min，PBST清洗3次，每次5 min。加入1%BSA稀释的 Cy3标记荧光二抗山羊抗兔（1∶500）避光于抗体孵育盒中室温孵育1.5 h。PBST避光清洗3次，每次5 min。DAPI避光染核5～8 min，PBS避光清洗3次，每次5 min。抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察和拍照。
1.8 Western blotting检测
搜集细胞样品，加入适量裂解液震荡混匀，置于冰上裂解45 min，超声粉碎，4 ℃ 17 000 r/min离心40 min，收集上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，并计算上样量。等量的蛋白样品液（40～50 μg）经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转至PVDF膜上，封闭后，按一定比例稀释一抗（ZO-1 1∶600；
occludin 1∶600）4 ℃孵育过夜。HRP标记的二抗室温孵育1.5 h。GAPDH作为内参。ECL发光、拍照，结果以目的蛋白与GAPDH的相对整合密度值比值表示。
1.9 统计学分析
采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。
2.1 MEG8在AD-ECs中的表达
结果显示，人脑微血管内皮细胞和AD-ECs中MEG8的表达分别为1.00±0.00和2.05±0.29。与人脑微血管内皮细胞比较，MEG8在AD-ECs中表达显著升高（P＜ 0.01）。
2.2 沉默MEG8的转染效率
应用qRT-PCR检测沉默MEG8的转染效率。结果显示，在质粒1和质粒2中，与shNC组比较，sh-MEG8表达均显著降低（P＜ 0.01），质粒1中的转染效率更高（P＜ 0.05）。因此选择质粒1筛选的细胞进行后续实验。见图1。
图1 AD-ECs中沉默MEG8的转染效率比较Fig.1 Comparison of transfection efficiency of deletion of MEG8 in AD-ECs
2.3 沉默MEG8表达对AD微环境下BBB通透性的影响
结果显示，与对照组比较，sh-NC组TEER值和HRP渗出量无显著变化（均P＞ 0.05）；
与sh-NC组比较，sh-MEG8组TEER值显著增加（P＜ 0.01），HRP渗出量显著降低（P＜ 0.01），提示沉默MEG8表达能够降低AD微环境下BBB的通透性。见图2。
图2 沉默MEG8表达对AD微环境BBB通透性的影响Fig.2 Effects of deletion of MEG8 on the BBB permeability of AD microenvironment
2.4 沉默MEG8对AD微环境下血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin分布的影响
结果显示，与sh-NC组比较，sh-MEG8组紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin呈现相对连续分布。见图3。
图3 沉默MEG8对AD微环境中紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin分布的影响Fig.3 Effects of deletion of MEG8 on the distribution of ZO-1 and occludin in AD microenvironment
2.5 沉默MEG8表达对AD微环境下血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin表达的影响
结果显示，与对照组比较，sh-NC组ZO-1和occludin的表达无统计学差异（均P＞ 0.05）。与sh-NC组比较，sh-MEG8组ZO-1和occludin表达显著升高（均P＜0.01），提示沉默MEG8表达能上调紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin表达水平。见图4。
图4 沉默MEG8表达对AD微环境下中ZO-1和occludin蛋白表达的影响Fig.4 Effects of deletion of MEG8 on the expression of ZO-1 and occludin in AD microenvironment
本研究首次证明了lncRNA MEG8在AD-ECs中高表达，沉默MEG8表达显著增加AD微环境下BBB的TEER值，降低HRP渗出量。此外，沉默MEG8表达使紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin在AD-ECs中表达显著增加，同时在AD-ECs的边界上呈现相对连续的分布，提示MEG8可能通过影响紧密连接相关蛋白的表达和分布进而调控AD微环境下BBB的通透性。
BBB是调节中枢神经系统稳态的动态和复杂的界面，血管内皮细胞的紧密连接相关蛋白是BBB的主要物理屏障组分，通过细胞旁途径调节通透性。TEER值是检测BBB完整性的指标，HRP渗出量是检测BBB渗透性的指标，同时检测TEER值和HRP渗出量是目前公认的研究BBB通透性的指标。既往研究［11］表明，AD微环境下BBB的通透性增加，与本研究结果一致。MEG8在AD-ECs中高表达，沉默MEG8表达显著增加了AD微环境下BBB的TEER值，降低HRP渗出量，提示沉默MEG8表达可显著降低AD微环境下BBB的通透性。
在调节BBB通透性的细胞旁途径中，血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的分布与表达水平的变化直接影响BBB通透性［12-13］。在AD的发生发展进程中，特别是AD发病的早期，BBB通透性的改变发挥重要调节作用［14］。本研究结果发现沉默MEG8表达使AD-ECs边界的紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin呈现相对连续的分布，显著增加了ZO-1和occludin的蛋白表达水平。有研究［15］报道，Aβ处理显著降低了血管内皮细胞紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的表达水平，损害了小鼠脑中BBB的完整性。上述研究结果均提示细胞旁途径的改变是AD早期BBB通透性变化的重要途径，而沉默MEG8表达可通过降低BBB的通透性发挥一定程度的保护作用。
近来研究［16］表明，lncRNA与PI3K-Akt、MTOR、AMPK等信号通路相互调节，调节AD的发生发展。lncRNA 17A在Aβ孵育的SH-SY5Y细胞中表达失调，过表达lncRNA 17A促进细胞自噬，诱导神经变性［17］。β-分泌酶1（beta-secretase 1，BACE1）与淀粉样蛋白沉积相关，研究［18］发现BEACE1反义链可通过调节BACE1的表达在AD的病理生理过程中发挥重要作用。本研究发现MEG8在AD-ECs中高表达。沉默MEG8表达使AD-ECs紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin呈现相对连续的分布，ZO-1和occludin表达水平显著增加。提示沉默MEG8的表达可通过改变ZO-1和occludin的细胞分布，增加ZO-1和occludin的蛋白表达水平来降低AD微环境下BBB的通透性，从而发挥一定的保护作用。LINC00662在Aβ处理的人脑ECs中高表达，沉默LINC00662表达可通过改变ZO-1、occludin和Claudin-5的细胞分布，增加Z O-1、occludin和Claudin-5的蛋白表达水平来降低AD微环境下BBB通透性［12］，与本研究结果类似。
综上所述，MEG8在AD-ECs中表达上调，沉默MEG8表达显著降低AD微环境下BBB的通透性，其作用机制可能是通过改变ZO-1和occludin的细胞分布，增加ZO-1和occludin蛋白表达实现的。MEG8在AD微环境下BBB的功能调节中可能发挥重要作用，但是，AD微环境下BBB的功能调节是多维度、多层次、多细胞、多分子共同参与的，因此，从不同层次的调控网络来探讨AD微环境下BBB通透性的变化，有望为AD的早期防治提供新策略。
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