李亚楠， 朱蕴兰， 陈宏伟， 王文斌， 方文艳
（徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏省食品生物加工工程技术研究中心，江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018）
桦褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）是一种珍稀药食真菌，主要分布于芬兰、波兰、俄罗斯西伯利亚、日本北部，以及我国黑龙江省和吉林省等寒冷地区。桦褐孔菌属担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属真菌，又名白桦茸、桦树菇等，常被誉为“西伯利亚灵芝”。桦褐孔菌无任何毒副作用，具有抗肿瘤、降血糖、降血压、抗病毒、增强免疫力、抗氧化、抗衰老、抑制病毒传播、抗过敏、抗炎等作用[1-5]。桦褐孔菌的主要化学成分包括多糖、羊毛甾烷型三萜类化合物、多酚、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、栓菌酸、叶酸衍生物、芳香族物质、单宁化合物、固醇类、生物碱类、黑色素类及木质素类化合物等[6-9]。近年来，研究人员在桦褐孔菌多糖、萜类等主要活性物质的提取、功能和深层发酵条件优化，以及药理作用和临床应用等方面进行了大量研究[10-16]。
桦褐孔菌作为药食两用真菌，已经被制作成胶囊、针剂、糖浆、茶汤、坐浴剂、气雾剂、调味品、面包、香肠、饼干、饮料、压片糖果等的加工辅助品和食用色素原料等[17]。随着环境质量的不断下降和快节奏生活压力的增加，越来越多的人处于亚健康状态，与此同时，由于人们对健康生活的需求而产生了众多的功能性食品，功能饮料是其中最为常见的产品之一。目前，桦褐孔菌饮料品种单一、数量有限，本研究通过生物技术方法提取桦褐孔菌的活性物质，优化桦褐孔菌复合饮料配方，测定饮料的抗氧化能力，希望为丰富功能性饮料市场的产品种类、满足特定人群的需求提供帮助。
1.1 试验材料
桦褐孔菌（Inonotus obliquus），购买于黑龙江大兴安岭森源山产品有限公司。
1.2 化学试剂
甲醇、苯酚、葡萄糖（天津市福晨化学试剂厂），浓硫酸（上海苏懿化学试剂有限公司），无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），乙酸乙酯（天津市致远化学试剂有限公司），香草醛（山东西亚化学工业有限公司），冰醋酸（西陇化工股份有限公司），高氯酸（天津市东方化工厂），异丙醇（上海建信化工有限公司），白桦脂醇（Sigma 公司），DPPH（源叶生物有限公司），以上均为分析纯。白糖（徐州市绿然食品有限公司），明胶（福建中兴食品配料有限公司），无水柠檬酸（福建中兴食品配料有限公司），茉莉花茶（芜湖市丰德林工贸有限责任公司），以上均为食品级。
1.3 试验仪器
800Y 型高速多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司），DHG-9075A 型电热鼓风干燥箱（上海慧泰仪器制造有限公司），TU-1810 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），FA2104N 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司），XO-SM100型超声波微波协同反应工作站（南京先欧仪器制造有限公司），L550 型台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），ST16R 型低温高速冷冻离心机（北京联合科力科技有限公司），YXQ-LS-100A 型立式压力蒸汽灭菌器（上海东亚压力容器制造有限公司），HH-4 型数显电子恒温水浴锅（常州国华电器有限公司），R201BL 型旋转蒸发器（上海电生科技有限公司），SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。
1.4 试验方法
1.4.1 试验流程
桦褐孔菌多糖和三萜类物质提取流程如图1 所示。桦褐孔菌饮料制备流程如图2 所示。
图1 桦褐孔菌多糖和三萜类物质提取流程Fig. 1 Extraction process of polysaccharides and triterpenoids from Inonotus obliquus
图2 桦褐孔菌饮料制备流程Fig. 2 Preparation process of beverage from Inonotus obliquus
1.4.2 桦褐孔菌多糖提取及含量测定
（1）桦褐孔菌多糖提取。将桦褐孔菌子实体在65 °C 条件下鼓风干燥至恒质量，粉碎后过40 目筛得到桦褐孔菌子实体粉末。准确称取5 g 桦褐孔菌子实体粉末样品放入烧杯，按1∶40 的料液比加入蒸馏水200 mL，搅拌，用400 W 超声波处理10 min，间隔10 s 共处理20 次，4 000 r/min 条件下离心15 min，取上清液，在55 °C 条件下旋转蒸发浓缩处理，得到桦褐孔菌粗多糖水提物，加入浓缩液4 倍体积的无水乙醇，摇匀，放于4 °C 冰箱12 h，8 000 r/min 条件下离心10 min，收集沉淀，用无水乙醇洗涤，将其放于60 °C 烘箱干燥至恒质量，即得桦褐孔菌粗多糖。
（2）桦褐孔菌多糖含量测定。以葡萄糖为标准品，采用苯酚−硫酸比色法测定。①葡萄糖标准曲线的制备。准确称取100 mg 葡萄糖标准品，在100 mL 容量瓶中定容，即得到浓度为1.0 mg/mL 的葡萄糖标准液。吸取配制的葡萄糖标准液10 mL，将其加入到100 mL 的容量瓶中定容，则制得终浓度为0.1 mg/mL 的葡萄糖标准应用液。取干燥具塞试管并1～6 标号，依次精密吸取葡萄糖标准系列应用液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 和1.00 mL （分别相当于葡萄糖0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 和0.10 mg）置于试管中，补水至2.0 mL，再向试管中加入1.0 mL 5 %的苯酚溶液和10.0 mL 浓硫酸溶液，充分混匀，将其沸水浴2 min，充分冷却，用蒸馏水于0 号管做相同处理为空白对照，在485 nm 波长处测定吸光值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，并求回归方程。②将提取的粗多糖溶于定量的蒸馏水中，吸取2 mL 按上述葡萄糖标准曲线制备方法测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线回归方程计算多糖含量。
1.4.3 桦褐孔菌三萜提取及含量测定
（1）桦褐孔菌三萜的提取。与多糖提取条件相同，将上清液旋转蒸发浓缩，放于60 °C 烘箱干燥至恒质量，得到水提粗三萜。
（2）桦褐孔菌三萜含量测定。以白桦脂醇为标准品，采取香草醛−冰醋酸−高氯酸分光光度法测定。①白桦脂醇标准曲线的制备。准确称取白桦脂醇标准品10 mg，将其加到小烧杯中，加入少量的甲醇溶液搅拌使其完全溶解，倒入250 mL 的容量瓶中，加入甲醇溶液定容，摇匀，即得到40 μg/mL 的标准品溶液。取干燥具塞试管并0～7 标号，依次精确吸取白桦脂醇标准品甲醇溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20和1.40 mL（分别相当于白桦脂醇0、8、16、24、32、40、48 和56 μg）于具塞试管中，沸水浴挥干溶剂，加入0.2 mL 新鲜配制的5%香草醛−冰醋酸溶液和0.8 mL的高氯酸，60 °C 水浴反应20 min，冰水冷却至室温，再加乙酸乙酯定容至5 mL，摇匀，用0 号管做参比，在550 nm 波长处测定吸光值，以白桦脂醇浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，并求回归方程。②将提取的粗三萜溶于定量的甲醇中，吸取1 mL，按上述白桦脂醇标准曲线制备方法测定吸光值，根据白桦脂醇标准曲线回归方程计算三萜含量。
1.4.4 桦褐孔菌提取液制备
按1∶40 的料液比，在同1.4.2 节桦褐孔菌多糖提取的超声与离心参数下，得到上清液，即桦褐孔菌提取液。
1.4.5 茉莉花茶提取液制备
准确称量4 g 茉莉花茶，冲泡于200 mL 的95 °C 水中，静置5 min，即得到0.02 g/mL 的茉莉花茶水溶液，经抽滤后得到没有悬浮物的茉莉花茶提取液。
1.4.6 桦褐孔菌饮料配方单因素试验
按流程方法制备饮料，选择桦褐孔菌提取液添加量（20%、25%、30%、35%、40%）、白糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、明胶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、柠檬酸添加量（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）、茉莉花茶提取液添加量（3%、4%、5%、6%、7%）的条件下，固定4 种因素添加原料的量，变化1 个因素进行单因素试验，采用感官评定方法对桦褐孔菌饮料感官指标进行评定。
桦褐孔菌饮料感官指标评定标准如表1 所示。测定时随机由10 人组成感官评定测试组进行测定，表示为X±S。
表1 桦褐孔菌饮料感官评定标准Tab. 1 Sensory evaluation standard of Inonotus obliquus beverage
1.4.8 桦褐孔菌饮料配方多因素正交试验
在单因素试验基础上，选择桦褐孔菌提取液、白糖、明胶、柠檬酸、茉莉花茶提取液5 个因素，设定4 个水平，以感官评分为指标进行L16（45）的正交试验，确定桦褐孔菌饮料的最佳配方。因素水平如表2 所示。
表2 正交试验因素水平Tab. 2 Factors and level of orthogonal experimental
1.4.9 桦褐孔菌饮料的稳定性测定
取适量桦褐孔菌饮料，在3 000 r/min 条件下离心30 min，将上清液稀释10 倍，在610 nm 波长下测定离心前及稀释后的吸光值，计算饮品的稳定系数R。
1.4.7 感官指标评定方法
1.4.10 桦褐孔菌饮料抗氧化能力测定
采用DPPH 自由基清除试验来测定抗氧化功能。用无水乙醇配制0.1 mmol/L 的DPPH 自由基乙醇溶液，避光保存待用。参照文献[18]方法，测定最佳配方制备的桦褐孔菌饮料DPPH 自由基清除率的具体试验方法如下。以Vc 溶液作参比，量取最佳配方下获得的桦褐孔菌饮料2 mL 及DPPH 溶液2 mL 加入到同一具塞试管中，充分摇匀，室温下暗处避光静置30 min 后，于517 nm波长处测定吸光度A样品，同时测定桦褐孔菌饮料2 mL与无水乙醇2 mL 相同处理的吸光度A对照，以及蒸馏水2 mL 与DPPH 溶液2 mL 相同处理的吸光度A空白，均平行测定3 次，求取平均值。
2.1 桦褐孔菌提取液多糖含量
葡萄糖标准回归方程为y=8.924 4x1+0.022，R2=0.992 8，式中y为吸光值，x1为葡萄糖浓度（mg/mL）。标准曲线结果表明，葡萄糖标准品在0～0.05 mg/mL 范围内与吸光度的线性关系良好，可以用于桦褐孔菌提取液多糖含量的测定。
经测定，桦褐孔菌提取液多糖浓度为2.5 mg/mL。
2.2 桦褐孔菌提取液三萜含量
三萜标准品白桦脂醇的回归方程为y=0.008x2+0.020 7，R2=0.993 6，式中y为吸光值，x2为白桦脂醇浓度（μg/mL）。标准曲线结果表明，白桦脂醇标准品在0～56 μg/mL 范围内与吸光度的线性关系良好，回归方程可以用于桦褐孔菌提取液三萜含量的测定。
经测定，桦褐孔菌提取液三萜浓度为0.248 mg/mL。
2.3 桦褐孔菌饮料配方单因素试验结果
2.3.1 桦褐孔菌提取液添加量
在固定白糖添加量为8%、明胶添加量为0.3%、柠檬酸添加量为0.2%、茉莉花茶提取液添加量为4%的条件下，添加不同量的桦褐孔菌提取液，对桦褐孔菌饮料感官指标进行评定，结果如图3 所示。当桦褐孔菌提取液的添加量达到30%时，感官得分最高。桦褐孔菌提取液添加量少，饮料颜色较浅，滋气味较为淡薄。当桦褐孔菌提取液添加量超过30%时，桦褐孔菌饮料口感略微苦涩，颜色过深。
图3 桦褐孔菌提取液添加量对饮料感官指标的影响Fig. 3 Effect of amount of Inonotus obliquus extract on sensory indexes of beverage
2.3.2 白糖添加量
在固定桦褐孔菌提取液添加量为30%、明胶添加量为0.3%、柠檬酸添加量为0.2%、茉莉花茶提取液添加量为4%的条件下，添加不同量的白糖，采用感官评定方法对桦褐孔菌饮料进行评定，结果如图4 所示。当白糖添加量达到8%时，感官得分最高。白糖添加量少，饮料甜味较为淡薄，酸甜不协调。当白糖添加量超过8%时，桦褐孔菌饮料过甜。
图4 白糖添加量对桦褐孔菌饮料感官指标的影响Fig. 4 Effects of white sugar supplemental level on sensory indexes of Inonotus obliquus beverage
2.3.3 明胶添加量
在固定桦褐孔菌提取液添加量为30%、白糖添加量为8%、柠檬酸添加量为0.2%、茉莉花茶提取液添加量为4%的条件下，添加不同量的明胶，采用感官评定方法对桦褐孔菌饮料进行评定，结果如图5 所示。当明胶添加量达到0.3%时，感官得分最高。明胶添加量少，饮料稳定性差。当明胶添加量超过0.3%时，桦褐孔菌饮料变得轻微黏稠和浑浊。
图5 明胶添加量对桦褐孔菌饮料感官指标的影响Fig. 5 Effects of gelatin supplemental level on sensory indexes of Inonotus obliquus beverage
2.3.4 柠檬酸添加量
在固定桦褐孔菌提取液添加量为30%、白糖添加量为8%、明胶添加量为0.3%、茉莉花茶提取液添加量为4%的条件下，添加不同量的柠檬酸，采用感官评定方法对桦褐孔菌饮料进行评定，结果如图6 所示。当柠檬酸添加量达到0.2%时，感官得分最高。柠檬酸添加量少，饮料酸味较为淡薄，酸甜不协调。当柠檬酸添加量超过0.2%时桦褐孔菌饮料变得过酸，酸味突出，口感差。
图6 柠檬酸添加量对桦褐孔菌饮料感官指标的影响Fig. 6 Effects of citric acid supplemental level on sensory indexes of Inonotus obliquus beverage
2.3.5 茉莉花茶提取液添加量
在固定桦褐孔菌提取液添加量为30%、白糖添加量为8%、明胶添加量为0.3%、柠檬酸添加量为0.2%的条件下，添加不同量的茉莉花茶提取液，采用感官评定方法对桦褐孔菌饮料进行评定，结果如图7 所示。当茉莉花茶提取液添加量达到5%时，感官得分最高。当茉莉花茶提取液添加超过5%时，饮料茉莉花茶的香气过重，掩盖住了桦褐孔菌特有的风味。
图7 茉莉花茶提取液添加量对桦褐孔菌饮料感官指标的影响Fig. 7 Effects of jasmine tea extract supplemental level on sensory indexes of Inonotus obliquus beverage
2.4 桦褐孔菌饮料配方正交试验结果
由表3 可知，各因素对桦褐孔菌饮料影响的主次顺序是桦褐孔菌提取液（A）>柠檬酸（D）>白糖（B）>明胶（C）>茉莉花茶提取液（E）。桦褐孔菌饮料的最佳配方为A4B3C4D3E3，即桦褐孔菌提取液35%、白糖10%、明胶0.4%、柠檬酸0.2%、茉莉花茶提取液5%。但与表中试验得分最高的10 号A3B2C4D3E1不同，因此再进行验证。根据配方A4B3C4D3E3和A3B2C4D3E1分别配制得到饮品Ⅰ和饮品Ⅱ，对二者进行感官评价，结果如表4 所示。
表3 正交试验结果与极差分析Tab. 3 Orthogonal test results and range analysis
表4 不同配方饮料的感官评分Tab. 4 Sensory scores of different formula drinks
由饮品Ⅰ最佳配方制备的桦褐孔菌饮料呈现焦糖色、澄清无沉淀，具有桦褐孔菌特有的风味和清淡的茉莉花香味，无其他异味。
2.5 桦褐孔菌饮料稳定性
对最佳配方制备的饮料进行稳定性测定，结果为稳定系数R=98.56%，表明最佳配方制备的桦褐孔菌饮料稳定性较好。
2.6 桦褐孔菌饮料的抗氧化能力
2.6.1Vc 对DPPH 自由基的清除率
按照试验步骤进行测定，测定结果以Vc 溶液浓度（μg/mL）为横坐标，DPPH 自由基清除率（%）为纵坐标绘制曲线，结果如图8 所示。
图8 Vc 对DPPH 自由基的清除率Fig. 8 Scavenging rate of Vc to DPPH free radical
2.6.2桦褐孔菌饮料对DPPH 自由基的清除率
经测定，最佳配方制得饮料对DPPH 自由基的清除率为52.12%，相当于饮料中约含有6 μg/mLVc。
桦褐孔菌提取液的多糖浓度为2.5 mg/mL，三萜浓度为248 μg/mL。桦褐孔菌饮料最佳配方为桦褐孔菌提取液添加量35%、白糖添加量10%、明胶添加量0.4%、柠檬酸添加量0.2%、茉莉花茶提取液添加量5%。桦褐孔菌饮料对DPPH 自由基清除率为52.12%。桦褐孔菌饮料呈焦糖色、澄清无沉淀，具有桦褐孔菌特有的风味和清淡的茉莉花香味，无其他异味，具有较好的稳定性和抗氧化活性，是一款具有较好市场发展前景的功能性饮料。本研究为丰富功能性饮料市场提供了依据。
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