高芳芳，单晓晓，杨 璇，李俊莹，周乐乐，张 越，陈卫东，张彩云(安徽中医药大学药学院药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，合肥 00；
安徽省教育厅现代药物制剂工程技术研究中心；
安徽省道地中药材品质提升创新协同中心；
安徽省中医药科学院药物制剂研究所；
中药复方安徽省重点实验室；
通讯作者,E-mail:cyzhang6@ustc.edu.cn)
茯苓始载于《神农本草经》，被列为上品，是沿用千年的药食两用大宗中药材[1]。茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，味甘、淡，平，归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿，健脾宁心之功效，可用于调理和治疗水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、心神不安等不适[2]。茯苓是自古医家最常用的中药之一，被称为“四时神药”，可与各种寒、湿、风、温药物配伍使用并发挥其独特的功效，有“十药九茯苓”之说[3-6]。近年来，人们对安全健康的药食同源药材的需求日益增长，茯苓市场需求量正在逐年攀升[7,8]。
现代药理研究表明，茯苓中三萜酸类成分是其重要的药效物质基础，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、镇静催眠等作用，引起国内外广泛关注[9-13]。其中，茯苓酸为羊毛甾-8-烯型三萜，单一纯品为白色粉末，是反映茯苓品质的重要指标[14-16]。2020版《中华人民共和国药典》仅采用薄层色谱鉴别控制茯苓药材的质量，难以全面反映其质量内涵[2]。因此本研究基于2020版《中华人民共和国药典》对茯苓性状、显微结构、理化特征、薄层色谱的评价指标，综合茯苓酸含量测定，对我国茯苓主产区药材进行全面的质量评价。
茯苓主要生长在我国安徽、湖北、云南等地，地区间自然环境的差异必定对茯苓药材的生长和质量产生一定的影响[17-19]。本研究分别从云南、湖北、安徽5个产地收集了25批茯苓样品，通过性状、显微结构、理化特征、薄层色谱及茯苓酸含量对茯苓开展系统评价，以期分析地区环境对茯苓药材质量的影响，为茯苓药材的质量标准研究、含茯苓的“经典复方”及“药食同源”食品开发等提供科学研究依据。
EX125DZH电子天平(奥豪斯仪器有限公司，常州)；
TOUPCAM显微镜(浙江舜宇光学科技有限公司)；
硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂)；
超声波清洗机(深圳市结盟清洗设备有限公司)；
Thermo U3000型高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；
乙腈为色谱纯(美国OCEANPAK公司)。乙醚、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸(国药集团化学试剂有限公司)。茯苓酸对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号PU0510-0025MG，98.78%)；
茯苓对照药材(中国食品药品检定研究院，批号12117-201910)；
茯苓药材、饮片采自云南腾冲、湖北罗田、安徽金寨、安徽霍山、安徽岳西，具体信息见表1；
茯苓药材由安徽中医药大学彭灿教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。
表1 不同批次茯苓采集信息Table 1 Information of different batches of Poria cocos from different producing regions
2.1 性状描述
取5个产地茯苓药材和饮片，按2020版《中华人民共和国药典》中规定方法对茯苓药材和饮片的形状、大小、表面、质地、断面、颜色、气味等特征进行描述，结果见图1。5个产地相同生长年限的茯苓药材，茯苓个呈类球形、椭圆形、扁圆形或不规则团块，大小不一。外皮薄而粗糙，棕褐色至黑褐色，有明显的皱缩纹理。体重，质坚实，断面颗粒性，有的具裂隙，外层淡棕色，内部白色，少数淡红色，有的中间抱有松根。茯苓气微，味淡，嚼之黏牙。以上茯苓药材性状与2020版《中华人民共和国药典》[2]一致。
A.云南腾冲茯苓药材；
B.安徽金寨茯苓药材；
C.湖北罗田茯苓药材；
D.安徽霍山茯苓药材；
E.安徽岳西茯苓药材；
F.云南腾冲茯苓块；
G.安徽金寨茯苓块；
H.湖北罗田茯苓块；
I.安徽霍山茯苓块；
J.安徽岳西茯苓块图1 不同产地茯苓药材和饮片Figure 1 Medicinal herbs and prepared slices of Poria cocos from different producing areas
茯苓为药典规定可以进行产地趁鲜加工的药材之一，因此本研究对比了5个产地茯苓块的性状，结果见图1。由图可见，5个产地的茯苓块均呈立方块状或方块状厚片，白色或淡红色，大小不一，其中湖北罗田的茯苓块切制的尺寸稍小。
2.2 鉴别
2.2.1 显微观察 取干燥的茯苓药材和饮片，按2020版《中华人民共和国药典》的显微鉴别法，对粉碎后药材粉末进行显微观察，结果见图2。可见，5个产地茯苓均有典型的无色不规则颗粒状团块和分枝状团块，及无色、淡棕色或有分枝的菌丝等显微结构特征，与2020版《中华人民共和国药典》描述一致。与云南腾冲、湖北罗田、安徽金寨、安徽岳西的茯苓相比，安徽霍山与湖北罗田茯苓显微观察的不规则团块较多，其他未见有明显差异。
2.2.2 理化鉴别 按2020版《中华人民共和国药典》规定对茯苓进行理化鉴别：取少量5个产地干燥的茯苓粉末于试管中，加适量碘化钾碘试液，结果见图3。可以看出5个产地25批茯苓均显深红色，与药典中记载一致。将样品于载玻片上比较分析，安徽霍山的茯苓粉末显色相对较深。
1～5.云南腾冲；
6～10.安徽金寨；
11～15.湖北罗田；
16～20.安徽霍山；
21～25.安徽岳西；
26.茯苓对照药材A.云南腾冲；
B.安徽金寨；
C.湖北罗田；
D.安徽霍山；
E.安徽岳西；
F.茯苓对照药材图3 茯苓粉末的理化特征图Figure 3 Physical and chemical characteristics of Poria cocos powder
2.2.3 薄层鉴别 分别各取25批茯苓药材粉末1 g，加乙醚50 ml，超声处理10 min后过滤。滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。
另取茯苓对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。
按照2020版《中华人民共和国药典》薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各2 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20 ∶5 ∶0.5)为展开剂，展开后取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸溶液-乙醇(4 ∶1)混合溶液，最后在105 ℃加热至斑点显色清晰[2]，结果见图4。由图可见，在供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，25批茯苓药材均显相同颜色的主斑点，说明各产地茯苓均符合药典薄层色谱评价要求。
1～5.云南腾冲；
6～10.安徽金寨；
11～15.湖北罗田；
16～20.安徽霍山；
21～25.安徽岳西；
26.茯苓对照药材图4 茯苓药材的薄层色谱图Figure 4 Thin layer chromatogram of Poria cocos
2.3 茯苓酸含量测定
2.3.1 色谱条件 本研究选用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸水(82 ∶18)；
流速为1.0 ml/min。柱温设置在30 ℃，检测波长为210 nm；
进样容积为10 μl。
2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取1 g过三号筛茯苓粉末，置于100 ml锥形瓶中，加入25 ml甲醇，称定质量，超声处理30 min，放冷，补足失重，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取茯苓酸对照品2.36 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为236.0 μg/ml的对照品储备液。
2.3.4 方法学考察
2.3.4.1 线性关系考察 取对照品储备液，用甲醇溶液分别配制成浓度为11.8，23.6，47.2，94.4，141.6，236.0 μg/ml的对照品溶液，按“2.3.1”项下方法进行检测，分别以茯苓酸浓度(X)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，建立回归方程Y=0.107 4X-0.099 8(R2=0.999 4)。可见，茯苓酸在11.8～236.0 μg/ml范围内线性关系良好。
2.3.4.2 专属性试验 取空白溶剂甲醇、对照品和供试品溶液按“2.3.1”项色谱条件下进样测定，具体HPLC色谱见图5。由色谱图可看出，空白甲醇峰与茯苓酸峰1分离良好，对照品和供试品溶液中茯苓酸峰测定无干扰，表明该方法专属性强。供试品溶液与对照品中茯苓酸色谱峰的保留时间为16.72 min。
S1.空白甲醇；
S2.供试品；
S3.对照品；
1.茯苓酸图5 对照品、供试品的高效液相色谱图Figure 5 High performance liquid chromatogram of reference and test sample
2.3.4.3 精密度试验 取安徽岳西茯苓(编号25)供试品溶液，按“2.3.1”项色谱条件下进样测定6次，测得茯苓酸含量的RSD为1.30%，表明仪器精密度良好。
2.3.4.4 稳定性试验 取安徽岳西茯苓(编号25)供试品溶液，于0，2，4，8，12，24 h在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得茯苓酸含量RSD为1.76%，表明溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.4.5 重复性试验 取6份安徽岳西茯苓(编号25)样品粉末1 g，精密称定后按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，测得茯苓酸含量RSD为1.49%，表明该方法重复性良好。
2.3.4.6 加样回收率试验 取已知含量的6份安徽岳西茯苓(编号25)样品粉末1 g，精密称定，置100 ml锥形瓶中，分别精密加入0.203 mg/ml的茯苓酸对照品溶液0.5 ml，按照“2.3.2”项下处理方法制备供试品溶液，按照“2.4.1”项色谱条件下进样测定，计算加样回收率，结果为104.46%(RSD=2.33%，见表2)，表明回收率良好。
表2 加样回收率试验结果Table 2 Results of recovery test
2.3.5 样品含量测定 分别精密量取各供试品、对照品溶液10 μl，注入液相色谱仪。结果显示，本次测定的25批茯苓，其茯苓酸含量范围为0.048 7%～0.113 7%。对每批茯苓饮片中茯苓酸含量计算平均值，其中安徽霍山茯苓的茯苓酸均值达到0.083 8%。相比其他4个产地，安徽霍山茯苓的茯苓酸含量高，其平均含量约为其他4个产地的1.05～1.68倍(见表3)。
表3 云南、湖北、安徽不同产地茯苓中茯苓酸含量测定结果Table 3 Determination results of Poria acid content in diffe-rent producing areas of Yunnan, Hubei and Anhui
茯苓被誉为中华九大仙草之一，作为药用保健品长达2000多年，古人把它称作“四时神药”，功效十分广泛[20]。但茯苓野生资源稀少，栽培品种又受地域限制，各个产地的茯苓质量不一，寻找长期稳定的茯苓饮片供应地至关重要[21]。为了建立科学可靠的茯苓质量评价体系，本研究在2020年版《中华人民共和国药典》收录规定对茯苓质量的检查方法评价的基础上，增加了茯苓重要的药效物质基础—茯苓酸含量测定[22-27]，以全面检查评价茯苓药材的质量。
本研究结果显示，云南、湖北、安徽3个地区5个产地25批茯苓的性状、显微结构、理化性质和薄层鉴定均符合2020版《中华人民共和国药典》要求。在显微、理化鉴别方面，安徽霍山与湖北罗田茯苓粉末中无色不规则颗粒状团块和分枝状团块较多，遇碘化钾碘试液显色也更明显，这表明安徽霍山与湖北罗田的茯苓所含多糖含量较其他3个产地丰富。在薄层色谱鉴别方面，5个产地茯苓与相应对照药材色谱在相同位置上均显示相同颜色主斑点。在茯苓酸含量方面，安徽霍山的茯苓酸含量较其他4个产地高。
造成茯苓成分差异的因素很多，如不同产地的地理环境、气候、土壤以及栽培技术，这些差异是否对茯苓药理作用造成影响，仍需进一步进行相关研究探讨[28]。本研究基于2020版《中华人民共和国药典》和茯苓酸含量测定，对安徽、湖北、云南3个地区5个产地茯苓进行了综合评价，可为我国茯苓药材和饮片产地选择和新产品开发提供参考依据。
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