王丽丽，赵 荣，何 悦，许 璐，雷美娜，彭 真，王四旺，肖会敏*
1.西安航天总医院，西安 710199；
2.陕西海天制药有限公司，咸阳 712000；
3.陕西含光生物科技有限公司，西安 710032；
4.西北大学生命科学与医学部，西安 710069
手足口病是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，表现为口痛、厌食、低热，以及手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿1周左右自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，目前尚无特效药。四季抗病毒合剂对手足口病与呼吸道感染具有较好的疗效[1-10]。四季抗病毒合剂(国药准字Z20027669)由鱼腥草、桔梗、桑叶、连翘、荆芥、薄荷、紫苏叶、苦杏仁、芦根、菊花、甘草11味中药组成，具有清热解毒、消炎退热的功能，用于治疗上呼吸道感染、病毒性感冒、流感、腮腺炎等病毒性感染性疾病。经检索文献，四季抗病毒合剂有含量测定研究[11-14]及抗手足口病基础研究[15-17]；
四季抗病毒合剂中含有新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、连翘酯苷B、连翘酯苷A、异槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、迷迭香酸、连翘苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫苏醛等成分[18-27]，但发现未有同时测定新绿原酸、绿原酸、咖啡酸等17种成分的研究报道。因此，本研究用高效液相色谱(HPLC)法同时测定制剂中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸等17种成分的含量，为控制本品质量、表征制剂中的主要活性成分提供依据。
1.1 仪器
Prominence UFLC高效液相色谱仪(日本岛津公司)；
Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典AKZO NOBEL公司)；
BSA124S型电子分析天平(赛多利斯公司)；
KQ-5200DE台式数控超声波清洗器(上海虔钧科学仪器有限公司)。
1.2 试药
四季抗病毒合剂(批号170201～170210)，鱼腥草，桔梗，桑叶，连翘，荆芥，薄荷，紫苏叶，苦杏仁，芦根，菊花，甘草(由陕西海天制药有限公司提供)。对照品：新绿原酸(批号MUST-10091501，质量分数≥98%)，购自成都曼思特生物科技有限公司；
绿原酸(批号110753-201716，质量分数≥99.3%)、咖啡酸(批号110885-201703，质量分数≥99.7%)、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸(批号111717-201402，质量分数≥94.5%)、连翘酯苷B(批号111811-201603，质量分数≥96.6%)、连翘酯苷A(批号111810-201606，质量分数≥93.4%)、异槲皮苷(批号111809-201403，质量分数≥92.9%)、甘草苷(批号111610- 201607，质量分数≥93.1%)、阿魏酸(批号110773-201614，质量分数≥99%)、橙皮苷(批号110721-201617，质量分数≥96.1%)、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(批号111782-201405，质量分数≥98%)、迷迭香酸(批号111871-201706，质量分数≥90.5%)、连翘苷(批号110821-201615，质量分数≥94.9%)、蒙花苷(批号111528-201710，质量分数≥96.6%)、槲皮素(批号100081-201610，质量分数≥99.8%)、甘草酸(批号110731-201619，质量分数≥93%)、紫苏醛(批号111806-201605，质量分数≥94.4%)，均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯(美国Honeywell公司)。
2.1 色谱条件
色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
以乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱程序见表1；
检测波长为277、254 nm；
记录时间为75 min；
流速为0.8 mL·min-1；
柱温为30 ℃；
进样量为5 μL。
表1 梯度洗脱程序
2.2 溶液的制备
2.2.1混合对照品溶液 分别精密称取新绿原酸6.90 mg、绿原酸4.80 mg、咖啡酸10.00 mg、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸11.00 mg、连翘酯苷B 16.60 mg、连翘酯苷A 18.00 mg、异槲皮苷22.00 mg、甘草苷6.40 mg、阿魏酸6.90 mg、橙皮苷8.00 mg、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸9.80 mg、迷迭香酸4.40 mg、连翘苷6.10 mg、蒙花苷4.10 mg、槲皮素11.20 mg、甘草酸6.50 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇适量，再精密称取紫苏醛10.6 mg加入量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得17种混合对照品溶液，其质量浓度分别为676.20、476.64、997.00、1 039.50、1 603.56、1 681.20、2 043.80、595.84、683.10、768.80、960.40、398.20、578.89、396.06、1 117.76、604.50、1 000.64 μg·mL-1，作为储备液。
2.2.2供试品溶液 取四季抗病毒合剂，精密量取1.0 mL，置于5 mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.2.3阴性对照溶液 根据四季抗病毒合剂处方，分别制备缺连翘(即连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷阴性对照品)，缺甘草(即甘草苷与甘草酸阴性对照品)，缺紫苏叶(即紫苏醛阴性对照品)、缺菊花、鱼腥草(即1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、新绿原酸、绿原酸、异槲皮苷的阴性对照品)，缺菊花、薄荷(即橙皮苷、蒙花苷阴性对照品)，缺紫苏叶、荆芥和芦根(即咖啡酸、迷迭香酸、阿魏酸阴性对照品)，缺菊花、桑叶和鱼腥草(即槲皮素阴性对照品)的模拟制剂，再根据2.2.2项分别制备相应的阴性对照溶液。
3.1 线性关系
吸取2.2.1项储备液12.5、62.5、312.5、625.0、1 250.0、2 500.0 μL，分别置于5 mL量瓶中，分别加甲醇至刻度，即得由新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、连翘酯苷B、连翘酯苷A、异槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、迷迭香酸、连翘苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫苏醛17种成分组成的系列质量浓度的混合对照品溶液，即1、2、3、4、5、6，分别用0.45μm微孔滤膜滤过，进样测得峰面积。以各对照品的质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(x)、峰面积值为纵坐标(y)，进行线性回归，绘制标准曲线。得线性方程、线性范围及相关系数(r)，见表2。结果表明，17种对照品在相应质量浓度范围内线性关系良好。
表2 线性关系测定结果
3.2 专属性实验
分别精密量取混合对照溶液、供试品溶液、各种阴性对照溶液各5 μL进样，记录色谱图。结果，阴性对照品无干扰，各峰分离度良好，见图1，表明该方法专属性强。
注：A.混合对照品(277 nm)；
B.混合对照品(254 nm)；
C.四季抗病毒合剂(277 nm)；
D.四季抗病毒合剂(254 nm)；
E.缺连翘对照品(即连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷阴性对照品，277 nm)；
F.缺甘草对照品(即甘草苷与甘草酸阴性对照品，277 nm)；
G.缺紫苏叶对照品(即紫苏醛阴性对照品，254 nm); H.缺菊花、鱼腥草对照品(即1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、新绿原酸、绿原酸、异槲皮苷的阴性对照品，277 nm)；
I.缺菊花、薄荷对照品(即橙皮苷、蒙花苷阴性对照品，277 nm)；
J. 缺紫苏叶、荆芥和芦根对照品(即咖啡酸、迷迭香酸、阿魏酸阴性对照品，277 nm)；
K.缺菊花、桑叶和鱼腥草对照品(即槲皮素阴性对照品，277 nm)；
1.新绿原酸；
2.绿原酸；
3.咖啡酸；
4. 1,3-O-二咖啡酰奎宁酸；
5.连翘酯苷B；
6.连翘酯苷A；
7.异槲皮苷；
8.甘草苷；
9.阿魏酸；
10.橙皮苷；
11. 3,5-O-二咖啡酰奎宁酸；
12.迷迭香酸；
13.连翘苷；
14.蒙花苷；
15.槲皮素；
16.甘草酸；
17.紫苏醛。
3.3 精密度实验
取混合对照品溶液6，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，测得新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、连翘酯苷B、连翘酯苷A、异槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、迷迭香酸、连翘苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫苏醛的峰面积的RSD值分别为1.87%、1.51%、1.32%、1.67%、1.49%、0.52%、1.57%、1.86%、0.90%、0.76%、1.32%、1.29%、0.18%、0.16%、0.62%、0.72%、0.18%，表明该方法精密度良好。
3.4 稳定性实验
取混合对照品溶液6，分别在第0、2、4、6、8、12、24 h进样。结果新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、连翘酯苷B、连翘酯苷A、异槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、迷迭香酸、连翘苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫苏醛的峰面积的RSD值分别为0.18%、0.57%、0.60%、0.43%、0.19%、0.11%、0.21%、0.30%、0.26%、0.17%、1.11%、1.20%、0.30%、0.33%、0.14%、0.49%、1.25%，表明该溶液在24 h内稳定。
3.5 重复性实验
精密称取6份样品(批号170202)，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果，各成分含量的RSD值均小于2%，见表3，表明该方法重复性好。
表3 重复性实验结果
3.6 加样回收实验
精密量取四季抗病毒合剂(批号170202)0.50 mL，按要求添加对照品，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，共制备6份样品，按照2.1项下色谱条件进样并测定峰面积，计算各成分的平均回收率(%)及RSD(%)。结果各成分平均回收率均大于96%，RSD值均小于2%。
3.7 含量测定
精密量取10批四季抗病毒合剂样品，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。10批样品中各成分含量的RSD值均小于2%，见表4，说明批次间各成分含量变化较小。
表4 四季抗病毒合剂中17种成分含量测定结果
4.1 检测波长的选定
用二极管阵列检测器对本试验所测定的17种成分进行全波长分析，最大吸收波长不一，新绿原酸(325 nm)、绿原酸(326 nm)、咖啡酸(322 nm)、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸(321 nm)、连翘酯苷B(330 nm)、连翘酯苷A(329 nm)、异槲皮苷(255、354 nm)、甘草苷(276 nm)、阿魏酸(322 nm)、橙皮苷(283 nm)、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(327 nm)、迷迭香酸(329 nm)、连翘苷(228、278 nm)、蒙花苷(268、334 nm)、槲皮素(255、371 nm)、甘草酸(250 nm)、紫苏醛(232 nm)。经过筛选200、254、277、320、348 nm波长，考察各波长的色谱信息，经比较发现，除紫苏醛以外的其他16种成分在277 nm处各峰分离度好，基线平稳，且峰形较好；
紫苏醛在波长254 nm处检出峰形较好，且其他峰也可显示。因此选择254 nm作为紫苏醛检测波长，其余16种成分选用277 nm。
4.2 其他色谱条件的选定
比较不同柱温(30℃、35℃)、制样采用不同稀释倍数(未稀释、稀释5倍、稀释10倍)，不同进样量(5、10 μL)时的色谱图。结果发现柱温为30 ℃、稀释倍数为5倍和进样量为5 μL时各峰分离度较好，特征性强，峰形较好，故确定柱温为30 ℃、制样稀释倍数为5倍和进样量为5 μL。流动相考察：
通过考察1 mL·L-1甲酸-甲醇、1 mL·L-1磷酸-甲醇、1 mL·L-1甲酸-乙腈、1 mL·L-1磷酸-乙腈等流动相体系，比较各流动相组成条件下色谱图中各组分基线状况、峰形、分离度等，结果表明，用乙腈-1 mL·L-1磷酸为流动相进行梯度洗脱时，基线平稳、色谱峰峰形良好、分离度高、谱图信息较为丰富。
4.3 专属性实验
据文献报道，新绿原酸、绿原酸、异槲皮苷主要来源于处方中的鱼腥草和菊花[18,20]；
咖啡酸、迷迭香酸主要来源于紫苏叶、荆芥和芦根[23,26-27]；
紫苏醛主要来源于紫苏叶[23]；
1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸来源于菊花[18]；
连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷来源于连翘[19]；
甘草苷、甘草酸来源于甘草[21]；
阿魏酸主要来源于芦根和紫苏叶[23,27]；
橙皮苷、蒙花苷主要来源于薄荷和菊花[18,24]；
槲皮素来自于菊花、桑叶和鱼腥草[18,20,22]。将各成分制备成相应的模拟制剂，依据供试品制备方法制成阴性对照溶液。结果显示，各个阴性对照均无干扰，说明专属性强。
总之，本实验通过高效液相色谱法对四季抗病毒合剂中17种成分进行了定量研究，制样方法简便，具有良好的重复性与稳定性，可用于评价四季抗病毒合剂的质量，也为四季抗病毒合剂临床应用提供了依据，为以后的药代动力学研究奠定了基础。
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