齐云峰，王雨琦，李铭新，徐振东，董成成，苏 建，张金玲，王 鹏
(1.吉林师范大学 生命科学学院，吉林 四平 136000；
2.吉林师范大学 化学学院，吉林 四平 136000)
皮肤黑色素瘤(SKCM)具有高度的侵袭性、耐药性和异质性[1].目前，手术切除仍是治疗原发性黑色素瘤的首选方法[2].此外新型的免疫治疗策略也取得了成功并提高了患者的生存率，如使用细胞抗毒性T细胞抗原4(CTLA-4)[3]、抗程序性死亡受体1(PD-1)[4]、恶性黑色素瘤相关性抗原A3(MAGE-A3)[5]的免疫治疗.接受免疫治疗的大部分患者有良好预后，但由于肿瘤微环境(TME)与肿瘤细胞之间相互作用的复杂性，仍有一些病人会产生不良反应，如自身免疫反应[6].利用表达谱数据估计恶性肿瘤组织中基质和免疫细胞(Estimation of Stromal and Immune cells in Malignant Tumor tissues using Expression data，ESTIMATE)算法可以预测肿瘤纯度以及肿瘤组织中浸润的免疫细胞和基质细胞的占比[7].通过评估黑色素瘤中免疫打分和基质打分来描述免疫和基质细胞的比例.肿瘤细胞的微环境情况影响免疫细胞的含量，而微环境验证过程中肿瘤和免疫过程密不可分[8].当肿瘤有较低的免疫细胞浸润时，低CD8+CTLs会使肿瘤对治疗产生耐药性[9].相比之下，随着免疫细胞浸润的增加，肿瘤对免疫疗法的敏感性增加[10].肿瘤微环境内的免疫细胞和肿瘤细胞都会争夺其中的物质资源，以确保自身发展.由于高代谢，肿瘤细胞将产生高酸性、缺氧和富含免疫抑制代谢物的肿瘤微环境，挑战免疫细胞的抗肿瘤作用[11].因此，有利于免疫细胞浸润并延长抗肿瘤T细胞寿命的综合免疫疗法，可能会明显提高治疗疗效[12].目前的研究表明，主要的抗肿瘤效应免疫细胞如细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞等免疫细胞在肿瘤微环境内的免疫活动中起主要的作用[13].在皮肤黑色素瘤中，肿瘤微环境会利用肿瘤浸润的免疫细胞维持免疫抑制作用，其中主要是淋巴细胞[14].分析免疫细胞及差异蛋白的互作关系可以为黑色素瘤的新治疗靶点和治疗方法提供创新见解[15].
本研究使用癌症基因组图谱数据库(TCGA)和基因表达量关联数据库(GTEx)中皮肤黑色素瘤(SKCM)的表达谱数据和患者的临床数据，并对样本分别进行免疫、基质和综合打分，探究肿瘤免疫微环境和皮肤黑色素瘤的相关性.
1.1 数据来源
RNA-Seq，临床数据来源于癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas，TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov)，正常皮肤数据来源于基因表达量关联数据库(The Genotype-Tissue Expression，GTEx，http：//genome.ucsc.edu/)，探针数据来源于基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).共从TCGA下载472个样品，从GTEx下载812个样品，共计肿瘤样品471个，正常样品813个.样品预处理均使用R语言(4.1.3版本)，并剔除临床信息不全样品.
1.2 肿瘤微环境打分
使用到ESTIMATE程序分析皮肤黑色素瘤中免疫细胞与基质细胞浸润水平，分析的数据来源于TCGA数据库.计算皮肤黑色素瘤中的基质细胞打分、免疫细胞打分和综合打分.
1.3 网络互作和富集分析
使用STRING网站(11.5版本，https：//cn.string-db.org/)计算交集基因的节点大小，最低要求互作分数大于0.700(High confidence).使用Cytoscape(3.9.1版本)绘出蛋白网络互作图.使用GSEA软件(4.2.3版本)分别对高低两组的前10个通路做富集合图.
1.4 统计学处理
使用线性回归模型(GLMM)比较正常样品与肿瘤样品之间基因表达差异，蛋白互作网络得到了预后相关的核心基因，并用箱线图来展示核心基因在正常和肿瘤样品的差异表达情况.基因表达与患者生存率之间的关系使用单因素Cox分析、多因素Cox分析与Log-rank检验方法.肿瘤微环境相关性、免疫细胞基质细胞打分使用Spearman或Pearson相关性分析.文章中所有的分析使用R语言(4.1.3版本)完成，并且使用到了Ggplot2、Limma、Survival、Pheatmap、VennDiagram、Enrichplot等R包绘制文章图片.
2.1 生存曲线
通过将肿瘤微环境的打分分数和对应样品的生存时间、生存状态进行合并，绘制三种不同打分的生存曲线图.图1(A)的生存曲线展示了随着时间的推移病人的生存率逐渐下降.并且根据免疫细胞的打分将病人样品分成高低打分两组之后，通过计算生存率得出高低两组的生存率具有显著差异(P<0.001)的结论.这说明皮肤黑色素瘤中免疫细胞的含量和生存率相关.其次在图1(B)的生存曲线展示了高低分两组的生存率是有差异的(P<0.05).这说明皮肤黑色素瘤中基质细胞打分和生存率相关.图1(C)的生存曲线说明免疫细胞和基质细胞的综合打分和病人的生存率相关(P<0.05).
图1 基于ESTIMATE算法的免疫细胞打分(A)、基质细胞打分(B)、免疫和基质细胞综合打分(C)的生存曲线
为方便分析这些差异基因之间的蛋白互作关系，得到蛋白网络互作图.图2(A)中每个节点代表基因或蛋白质.图2(B)展示了这些基因连接的基因节点数，基因节点数越大，代表此基因连接的基因就越多，同时说明这个基因越重要.图中显示出来的基因则是网络核心基因的备选基因.最后发现IL2RA与CD247、CD28、CD3G、CD69、CD8B、IFNG、IL7R、LCK和PTPN22之间互相关联.
图2 蛋白网络互作图(A)和网络核心基因(B)
经过Cox回归分析，得到预后相关的基因(P<0.05)，及其相对风险比(Hazard Ratio，HR)值.通过蛋白网络互作得到的核心基因和Cox回归分析得到的预后基因之间的交集，最终结果是IL2RA基因.接下来对IL2RA基因进行单基因分析，通过图3(A)和(B)看出IL2RA基因在肿瘤样品和正常样品是具有显著差异的(P<0.001)，同时也能看出IL2RA基因在肿瘤组显著上调.说明IL2RA基因在肿瘤样品中高表达.然后对IL2RA基因进行生存分析，根据目标基因的表达量，将病人样品分成高表达组和低表达组，观察IL2RA基因图3(C)的生存曲线，说明IL2RA基因和预后相关(P<0.05).
IL2RA基因在肿瘤发生过程中的免疫相关信号(Immunologic signatures)根据表达情况分成高低表达两组.分别取富集最显著的前10个(|log2FC|>0.5、P<0.05)做多信号富集分析图.图4(A)中表示基因的表达越高，这些免疫信号越活跃，即两者之间是正相关的.图4(B)中表示基因的表达越高，这些免疫信号越不活跃，即两者之间是负相关.
图3 单基因差异分析(A)，配对差异基因(B)和生存分析(C)
续图3
图4 正相关免疫信号的多GSEA富集图(A)和负相关免疫信号的多GSEA富集图(B)
计算每个样品中免疫细胞的相对含量之后，在免疫细胞柱状体里体现出含量比.图5(A)中横坐标是样品名字，纵坐标是免疫细胞的相对含量，可以直观地观察到每种免疫细胞含量在各个样本中的比例.根据目标基因的表达量，将病人样品分成高低表达两组，比较免疫细胞在高低两组的差异情况.图5(B)的小提琴图展示了各个免疫细胞在高低两组的表达量以及在两组之间的差异情况.其中，γδT细胞(T cells gamma delta)、静止NK细胞(NK cells resting)、活跃NK细胞(NK cells activated)和静止肥大细胞(Mast cells resting)在高低表达两组有差异(P<0.05).浆细胞(Plasma cells)、CD8 T细胞(T cells CD8)、活跃CD4 T记忆细胞(T cells CD4 memory activated)、调节性T细胞(Tregs)、单核细胞(Monocytes)、M0期巨噬细胞(Macrophages M0)和M2期巨噬细胞(Macrophages M2)在高低表达两组有显著差异(P<0.001).
图5 免疫细胞柱状图(A)和免疫细胞差异分析的小提琴图(B)
将基因的表达量和免疫细胞的含量进行相关性检验，图6展示了IL2RA基因的表达量和免疫细胞的相关性情况.同时可以看出所有的免疫细胞和IL2RA基因的表达量都呈显著相关(P<0.05)，其中天然B细胞(B cells native)、静息状树突状细胞(Dendritic cells resting)、M1期巨噬细胞(Macrophages M1)、单核细胞(Monocytes)、活跃NK细胞(NK cells activated)、浆细胞(Plasma cells)、活跃CD4 T记忆细胞(T cells CD4 memory activated)、CD8 T细胞(T cells CD8)和调节性T细胞(Tregs)与IL2RA基因相关系数大于0，即二者之间呈正相关.其余免疫细胞的含量与IL2RA基因呈负相关，即IL2RA基因的表达量越高，免疫细胞的表达量越低.
图6 免疫细胞相关性
本文对皮肤黑色素瘤的肿瘤微环境情况和打分进行了系统、全面的表征分析，并对免疫浸润细胞的占比等也进行了展示.免疫细胞在不同肿瘤微环境中的表达情况是不相同的.其中浆细胞，CD8 T细胞，活跃CD4 T记忆细胞，调节性T细胞，单核细胞，M0期巨噬细胞和M2期巨噬细胞在高低评分两组之间差异显著.通过寻找预后相关基因和免疫基质细胞评分获得差异表达基因的交集，找到IL2RA基因，这说明IL2RA基因可能在皮肤黑色素瘤中起着重要的靶点作用.根据IL2RA基因的表达情况，分析病人的预后生存情况和其中免疫细胞、基质细胞的含量比.综上所述，本研究表明IL2RA基因对皮肤黑色素瘤的预后有异质性，并且发现所有免疫细胞的含量和IL2RA基因显著相关.此研究对皮肤黑色素瘤在肿瘤微环境和免疫细胞浸润情况进行了阐释，为日后临床上的免疫治疗提供了新的治疗和研究靶点.
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