俞丁宁， 石映红， 钱晖
(江苏大学医学院，江苏 镇江 212013)
肿瘤传统治疗方法主要有手术、化疗、放疗和靶向疗法[1]，而肿瘤的免疫治疗通过调控患者免疫系统，调动机体免疫反应能力来攻击肿瘤细胞，已成为继传统疗法之后的一种有效治疗途径[2]。肿瘤免疫治疗的目的是采用一系列策略来启动和优化先天或获得性免疫系统的三个关键程序：监控、识别和攻击肿瘤[3]。
CD8+T细胞是抗肿瘤反应中极具破坏性的免疫效应细胞群，初始CD8+T细胞在被负载肿瘤抗原的抗原提呈细胞激活后形成CD8+细胞毒性T细胞，循环到肿瘤部位诱导免疫清除反应[3]。CD8+T细胞对肿瘤细胞产生的细胞毒作用主要通过经典的穿孔素/颗粒酶释放途径和死亡受体途径来实现。此外，诱导细胞焦亡和细胞毒性外泌体的释放也被认为是可能的杀伤肿瘤细胞的新途径[4]。目前，肿瘤治疗领域的快速发展对临床研究提出了更高的要求，根据不同患者制定个性化免疫治疗策略，已成为研究人员未来需要攻克的重大课题之一。本文重点介绍了基于CD8+T细胞的肿瘤免疫治疗策略，旨在为CD8+T细胞在临床肿瘤治疗提供参考依据。
基于CD8+T细胞的肿瘤免疫治疗手段的不断涌现标志着CD8+T细胞在抗肿瘤治疗中取得进展，其在临床转化中的价值和潜力备受关注[5]。CD8+T细胞在肿瘤免疫治疗中的应用策略见图1。
图1 CD8+ T细胞在肿瘤免疫治疗应用中的不同策略
1.1 免疫检查点疗法
免疫检查点是可以调节免疫系统应答能力的一系列分子，为维持免疫系统的稳定提供了保障[6]。但一些肿瘤细胞可以利用这种机制，向表达免疫检查点的免疫细胞传递抑制性信号，从而改变被清除的命运[7]。免疫检查点阻断疗法利用免疫检查点封闭剂缓解CD8+T细胞受到的抑制性压力，恢复其对肿瘤细胞的敏感性和杀伤能力[3，8]。程序性死亡蛋白-1(programmed death 1，PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)、含免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)结构域的T细胞免疫受体(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG3)、T细胞免疫球蛋白和黏蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin 3，TIM3)等免疫检查点已被证明在免疫系统中发挥重要作用，靶向上述检查点的单克隆抗体也不断涌现[8]。伊匹单抗(抗CTLA-1抗体)是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的第一个用于肿瘤免疫治疗的免疫检查点阻断剂药物[9]。此后FDA分别于2015年和2016年批准了两种PD-1单抗治疗药物纳武单抗和阿替利珠单抗[3，9]，又在近期批准了LAG-3抗体和PD-1抗体的组合产品Opdualag的使用，这是LAG-3抗体药物首次被FDA批准使用[10]。
然而，越来越多的研究表明，单独应用免疫检查点阻断药物仅对少数肿瘤患者有效，大多数患者未能达到期望的临床治疗效果甚至会产生不良反应[6，8]。因此，目前针对免疫检查点疗法，多关注预测性生物标志物(外周血淋巴细胞比例分析、肿瘤细胞受体蛋白表达、肿瘤细胞的基因组分析等)的研究[8，11]。Hugo等[12]研究显示，乳腺癌易感基因2与PD-1单抗的治疗效果有关。由此可见，预测性生物学信号的早期检测，可以提高临床肿瘤药物应用选择中“对症下对药”的比率。此外，开展药理学研究，协同使用不同免疫检查点抑制剂或其他不同治疗机制的药物或疗法，可以获得“1+1≥2”的治疗效果[13]。2019年美国癌症研究协会的年会报道[14]，使用抗CD40单抗APX005M、DNA合成抑制剂吉西他滨、白蛋白结合型紫杉醇联合抗PD-1单抗纳武单抗进行了4种药物的联合用药，对胰腺癌患者开展Ⅰ期临床试验，取得了积极效果。因此，可通过有效的临床设计和临床数据分析确定针对不同疾病的最佳联合用药方案。此外，针对个体肿瘤衍生的个性化新抗原疫苗也是一个有效策略。
1.2 新抗原和疫苗
以往对肿瘤疫苗抗原靶标选择的关注主要集中在肿瘤特异性抗原(如NY-ESO-1、5T4和CEA)和肿瘤相关抗原(如HER2、Ras、p53、muc-1和MART-1)[15-17]。通常来说，宿主细胞变异产生肿瘤细胞的一些标志蛋白很难与正常宿主细胞区分，而肿瘤细胞上的新抗原源自肿瘤细胞的二次突变，与正常细胞的表达存在较大区别，致使机体免疫系统对肿瘤新抗原具有较强的免疫识别能力[17]。因此，新抗原特异性肿瘤疫苗是诱导宿主产生强烈且稳定的免疫反应的优选策略，是免疫疗法取得成功的重要辅助手段[18]。随着生物信息学技术方法的涌现以及预测性抗原筛选鉴定技术的优化，新抗原疫苗的研究进展迅速[19]。
Keskin等[20]为胶质母细胞瘤患者设计了新抗原个性化肿瘤疫苗，成功促进CD8+T细胞的抗肿瘤反应。Ali等[21]提出了一种从T细胞激活切入的研究方案，其在体外设计了表达新抗原表位mRNA的树突状细胞疫苗，接种到健康供体，成功激活了相应新抗原反应性CD8+T细胞用于肿瘤的治疗。胰腺癌是一种免疫原性低和T细胞浸润水平低的肿瘤，Kinkead等[22]使用新抗原疫苗PancVAX(诱导CD8+T细胞在肿瘤部位聚集)联合抗PD-1单抗(抑制免疫耐受信号)和激动剂抗体OX40(诱导T细胞记忆)三联疗法治疗胰腺癌荷瘤小鼠，发现肿瘤消退增加，小鼠存活率提高。综上，迫切需要更好地了解肿瘤性质，并阐明其免疫抵抗和逃逸机制，以帮助研究人员开发更有效的个性化治疗策略。
1.3 细胞免疫疗法
过继性细胞疗法(adoptive cell therapy，ACT)是当下肿瘤治疗中极具发展前景的领域，该疗法通过动员个体外周血中的CD8+T细胞，在体外进行转化和扩增，获得对肿瘤细胞的特异性识别能力后回输给患者，特异性杀死肿瘤细胞[23]。最初，ACT使用的治疗细胞来源于患者自身的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)，但受限于TILs的数量少，从根本上增强杀伤效应较为困难[24]。
基因修饰是ACT中比较常用的CD8+T细胞转化方法，通过修改T细胞识别肿瘤特异性靶标的基因，可以解决一些由于肿瘤免疫逃逸引起的TILs低丰度的问题。其中，T细胞受体基因修饰T细胞(T cell receptor engineered T cells，TCR-T)疗法和嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)疗法是最新和最具潜力的免疫治疗策略[25]。CAR-T细胞是通过基因编辑技术将目的CAR表达在CD8+T细胞上[26]，而TCR-T细胞通过基因工程将T细胞受体表达在CD8+T细胞膜[27]。迄今为止，CAR-T和TCR-T细胞介导的免疫疗法已在免疫系统和血液肿瘤中显示良好疗效。最近，我国自主研发了靶向B细胞成熟抗原的CAR-T细胞，成为首个被美国FDA批准的中国本土CAR-T治疗产品[5，28]。然而，CAR-T和TCR-T细胞疗法在实体瘤中的应用仍面临一些挑战，存在肿瘤微环境抑制、T细胞衰竭、肿瘤抗原多样性引起的“脱靶”效应及ACT衍生的毒性等问题[25，29]。
就实体瘤而言，单一靶点的CAR-T细胞和TCR-T细胞疗法的疗效有限，而双靶点甚至多靶点疗法可以提高免疫细胞对肿瘤细胞的靶向覆盖率，大幅度降低“脱靶”效应[30]。将抑制性CAR分子添加到TCR-T细胞中，该抑制性CAR分子靶向正常组织特异性抗原同时融合PD-1或CTLA-4的抑制性结构域，CAR接触到正常细胞驱动的抑制性反应避免了对正常细胞的毒性“误伤”，赋予了CD8+T细胞区分敌我的能力，从而减少“脱靶”效应[27]。实体瘤的高度抑制性微环境和抗原多样性导致鉴定CAR-T靶点困难重重[30-31]。Corina等[32]选择不分裂或不形成抑制性微环境的衰老细胞作为CAR-T细胞靶点，利用CAR-T细胞靶向衰老细胞表面的尿激酶型纤溶酶原激活物受体来治疗肺腺癌模型小鼠，延长了小鼠的生存时间。将表达肿瘤抗原的溶瘤病毒疫苗引入ACT可以放大CAR-T细胞与肿瘤之间的相互作用，迅速消除肿瘤，然而，溶瘤病毒诱导的肿瘤炎症环境的成分复杂，需要综合考虑后进行运用[33]。
1.4 纳米医学疗法
使用纳米颗粒递送药物的方法具有直接靶向需要免疫反应部位的特点，增强了局部肿瘤免疫反应的启动速度，由此引起的免疫反应更加迅速可靠，对患者机体的毒性也更小[34]。根据精准治疗的目标和CD8+T细胞的激活情况，可以将纳米疗法概括为以下三类。
1.4.1 靶向肿瘤细胞，诱发免疫原性细胞死亡，激活CD8+T细胞 在奥沙利铂的光敏剂包被的纳米聚合物联合PD-L1抗体治疗结肠癌动物模型的研究中[35]，肿瘤细胞通过高通透性和滞留效应吞噬纳米颗粒，发生细胞凋亡，肿瘤细胞内部的钙网蛋白表露，提高了肿瘤的免疫原性，促使CD8+T细胞聚集产生免疫反应，提示用纳米疗法针对肿瘤抗原的暴露，提高肿瘤免疫原性，能够提高CD8+T细胞的抗肿瘤水平。
1.4.2 靶向免疫微环境，促进CD8+T细胞增殖和浸润 新抗原纳米疫苗偶联Toll样受体7激动剂和Toll样受体8激动剂可以诱导树突细胞成熟，延长树突细胞抗原呈递的持续时间，提高肿瘤附近CD8+T细胞的响应程度[36]。研究表明[37]，使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒递送松弛素至肿瘤细胞外基质会显著降低胰腺癌模型中纤维化的产生。Wu等[38]利用髓源性抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)与新设计的磁性氧化铁纳米颗粒之间的相互作用，证明将纳米颗粒掺入MDSCs中，能够影响MDSCs的功能并操纵MDSCs复极化为M1炎症表型，从而产生大量TNF-α和一氧化氮合成酶，部分缓解了肿瘤微环境中CD8+T细胞受到的抑制作用。
1.4.3 靶向外周免疫系统再激活和扩增CD8+T细胞 包裹编码CAR和TCR的mRNA包裹的PbAE/PGA-anti-CD8纳米颗粒能够选择性地结合循环血液中的CD8+T细胞并被内化，随着CD8+T细胞中mRNA的释放，T细胞被重编程以瞬时表达肿瘤特异性CAR和TCR，从而在原位诱导类似于传统的过继转移T细胞的抗肿瘤反应[39]，极大缩减了基因编辑CD8+T细胞繁琐的工序，显示出纳米颗粒原位编程平台高效应用的潜能。
三级淋巴结构(tertiary lymphoid structure，TLS)类似于二级淋巴器官，主要由T、B淋巴细胞等免疫细胞组成，普遍存在于慢性炎症和肿瘤。TLS以体液免疫的方式分泌抗体或将抗原呈递给T细胞，与CD8+T细胞协同杀伤肿瘤[40]。靶向TLS促进TLS中T和B细胞的功能成熟并改善不良反应是纳米医学研究的一个新方向。
外泌体属于小细胞外囊泡(直径30～150 nm)，是在分泌性囊泡概念提出的基础上，按照大小对囊泡进行更精细分类后，归类出的一个研究最为广泛的分泌性小细胞外囊泡亚群[41]。外泌体能够被多种类型细胞分泌，在体液中以全身循环的形式，与近处或远处内化外泌体的细胞进行信息交互。研究发现CD8+T细胞来源的外泌体可能是CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞的一种潜在机制[42](图2)。然而，免疫细胞衍生的外泌体，其功能很大程度上受到其亲代细胞的免疫状态的影响，迄今为止，对于CD8+T细胞衍生的外泌体，在肿瘤背景下的细胞毒性效应能力还不明确，尚存在争议。
图2 CD8+ T细胞杀伤肿瘤细胞的潜在机制
研究显示[43]，活化的CD8+T细胞可以通过外泌体，破坏间充质肿瘤基质细胞，抑制肿瘤细胞侵袭和转移能力。CAR-T细胞衍生的外泌体中含有CAR分子、颗粒酶B和穿孔素，能诱导肿瘤细胞的细胞死亡并减缓体内肿瘤生长，在体内外都发挥较好的抗肿瘤效果，且未伴随明显的不良反应[42]。由IL-12刺激的CD8+T细胞衍生的外泌体，其颗粒酶浓度大大增加，同时具有补偿刺激周围幼稚CD8+T细胞活化的能力[44]。但也有不同的观点指出，CD8+T细胞衍生的外泌体对肿瘤的生长是有利的。早期研究认为CD8+T细胞衍生外泌体会增加肿瘤细胞基质金属蛋白酶9的表达，从而促进肿瘤进展[45]。此外，CD8+T细胞来源外泌体通过抑制树突细胞介导的CD8+T细胞增殖，降低了抗肿瘤反应的效果[46]。
总之，对于CD8+T细胞来源的外泌体，目前研究还处于摸索阶段，亟待更多的研究数据对其系统化的分类定性，以确定CD8+T细胞来源的外泌体在肿瘤中的具体效应以及是否会在未来的临床诊断和治疗中发挥独特的作用。
基于CD8+T细胞的肿瘤免疫疗法在临床实践中的实效，特别是不同学科间的交叉互动，使得结构生物学、基因组学、纳米医学及生物信息学中的新型技术不断补充添加到CD8+T细胞的研究中，极大推动了CD8+T细胞肿瘤免疫治疗前进的步伐。但从现实情况来看，肿瘤免疫逃逸、不同疗法的毒副作用、CD8+T细胞外泌体抗肿瘤效果的不确定性等科学技术层面的阻碍亟待解决，同时细胞免疫治疗价格昂贵所带来的个体经济层面的压力仍然存在，基于这些问题，建立一个安全、经济和有效的CD8+T细胞及其外泌体的肿瘤免疫治疗平台是未来临床研究人员仍需不断奋斗的目标。
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